Assay & Application Notes

ELISA-Assay: Leistungsbenchmark-Analyse des Absorbance 96 ELISA-Readers

ELISA Assay: Benchmark Performance Analysis of Absorbance 96 ELISA Reader

Wichtigste Ergebnisse

  • Die umfassende Vergleichsanalyse ergab keinen signifikanten Leistungsunterschied zwischen dem Absorbance 96 ELISA-Reader und anderen herkömmlichen Platten-Readern.
  • Der Absorbance 96 ELISA-Reader zeigt eine außergewöhnliche Kompatibilität mit Enzos ELISA-Kits über ein breites Spektrum hinweg.
  • Die Studie liefert eine definitive Validierung des Absorbance 96 als neue Kategorie von Mikroplatten-Readern für die Durchführung von ELISA-Assays.

Einleitung

Seit seiner Einführung hat sich der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zu einem weit verbreiteten und hochzuverlässigen Werkzeug zur Quantifizierung verschiedener Analyten entwickelt, von kleinen Molekülen bis hin zu quaternären Proteinkomplexen. Er ist zu einem Arbeitspferd für eine Vielzahl von Forschungsbereichen geworden und wird häufig für analytische und diagnostische Zwecke eingesetzt. Kleine Laboratorien und feldbasierte Forschungsteams werden jedoch durch das Fehlen erschwinglicher, tragbarer und wartungsarmer ELISA-Reader behindert.

Diese Anwendungsnotiz bewertet und vergleicht die Leistung eines ultrakompakten ELISA-Readers, Absorbance 96, mit anderen kommerziell erhältlichen Tischgeräten für Mikroplatten-Reader. Um beide Gerätetypen zu vergleichen, wurden eine Vielzahl von experimentellen Aufbauten parallel durchgeführt, unter Verwendung der gängigsten ELISA-Substrate (TMB – Tetramethylbenzidin und pNpp p-Nitrophenylphosphat). Diese Studie wurde in Zusammenarbeit mit Enzo Life Sciences durchgeführt.

Ergebnisse

Zur Bewertung der Leistung des Absorbance 96 ELISA-Readers für ELISA-basierte Assays wurde eine Reihe vergleichender Bewertungen mit zwei weiteren kommerziell erhältlichen Mikroplatten-Readern durchgeführt – PowerWave XS2 (BioTek Instruments) und SpectraMax 250 (Molecular Devices).

Der Absorbance 96 ELISA-Reader zeigte eine vergleichbare Well-to-Well-Variation

Für Präzisionstests wurden die Well-to-Well-Variation und die Wertvariation der Blank-korrigierten optischen Dichte (OD) über Geräte hinweg analysiert, indem ein homogenes, vorentwickeltes TMP-Substrat gemessen wurde (Abb. 1). Alle drei Geräte zeigten eine vergleichbare Datenstreuung und keine statistisch signifikanten Unterschiede. Der Absorbance 96 ELISA-Reader zeigte einen etwas höheren Interquartilbereich (IQR) sowie eine extremere Streuung als die beiden anderen Geräte, aber die Variationen von Mittelwert und Median waren bei allen Geräten vergleichbar.

Abbildung 1: Präzisionstest. Eine Lösung von entwickeltem TMB-Substrat mit identischer optischer Dichte (OD) wurde in Wells einer Mikroplatte pipettiert und in drei verschiedenen Geräten abgelesen. (A) Die Variation der Wells innerhalb jedes Geräts wird als Box-Whisker-Plot dargestellt. (B) Relative OD-Wertänderung über einzelne Reihen der Platte für alle drei Geräte. Die Mittellinie zeigt den Median, die Box den Interquartilbereich (IQR) vom ersten bis zum dritten Quartil, die Whiskers +/- 1,5xIQR und die Punkte zeigen Ausreißer.

Insgesamt wurde eine geringe und vergleichbare Messvariabilität beobachtet

Für die Intra- und Intermessvariationsprüfung wurden Ergebnisvariationen zwischen Duplikaten innerhalb einer Messung mit einem einzigen Gerät sowie die Variation des Mittelwerts von Duplikaten, die mit einem der beiden Geräte bestimmt wurden, verglichen und grafisch dargestellt (Abb. 2-5). Variationen zwischen zwei Messungen oder Mittelwerten werden sowohl als ΔOD als auch als %CV dargestellt, da %CV dazu neigt, geringfügige Änderungen bei sehr niedrigen OD-Werten zu übertreiben, während ΔOD bei normalen Änderungen hoher optischer Dichten relativ hohe absolute Werte liefert.

Abbildung 2: Intra- & Intermessvariationsprüfung. IgG2b (Maus)-Proben wurden in Duplikaten pipettiert, und die Variation zwischen den Probenduplikaten wurde mit jedem Gerät sowie die Variation des Mittelwerts zwischen beiden Geräten bestimmt. (A/A’) Variationen der Probenduplikate pro Gerät und Unterschiede im Probenmittelwert zwischen den Geräten werden als (A) ΔOD sowie (A’) %CV dargestellt. Boxplot-Daten werden als Box-Whisker-Plot dargestellt. Die Mittellinie zeigt den Median, die Box den IQR, die Whiskers +/- 1,5xIQR, und die Punkte zeigen Ausreißer.

Abbildung 3: Intra- & Intermessvariationsprüfung. TNF-α (Maus) ELISA wurde durchgeführt und die resultierenden Platten wurden zweimal mit jedem Gerät gemessen. (A/A’) Variation zwischen wiederholten Messungen innerhalb eines Geräts sowie die Variation des Mittelwerts von zwei Messungen an beiden Geräten. Abweichung der blank-korrigierten Messungen dargestellt als (A) ΔOD oder (A’) %CV. (B) Zwei Standardkurven wurden erstellt und mit jedem Gerät gemessen. Gemessene OD-Werte werden gegen bekannte Standardkonzentrationen aufgetragen. (C/C’) Variationen der erhaltenen Standardwerte zwischen beiden Geräten werden als (C) ΔOD oder (C’) %CV dargestellt. Boxplot-Daten werden als Box-Whisker-Plot dargestellt. Die Mittellinie zeigt den Median, die Box den Interquartilbereich (IQR) vom ersten bis zum dritten Quartil, die Whiskers +/- 1,5xIQR, und die Punkte zeigen Ausreißer.

Die Gesamtvariabilität der Messungen war gering und auf einem vergleichbaren Niveau zwischen den Geräten. Variationen zwischen Ablesungen physikalischer Probenduplikate (Abb. 2) waren vergleichbar zwischen dem Absorbance 96 ELISA-Reader und dem PowerWave XS2 Platten-Reader und beruhen wahrscheinlich hauptsächlich auf physikalischen Variationen zwischen den Probenduplikaten selbst. Variationen zwischen wiederholten Ablesungen (Abb. 3-4) waren für beide Geräte vergleichbar, unabhängig davon, ob TMB- oder pNpp-Substrat-basierte ELISA-Kits gemessen wurden. Unterschiede zwischen den Werten, die von beiden Geräten bestimmt wurden (Abb. 2-4), wie sie durch den Unterschied im Mittelwert wiederholter Messungen mit jedem Gerät sichtbar sind, lagen im erwarteten Bereich. Alle Variationen lagen gut innerhalb des erwarteten Bereichs, wobei die 3. Quartilsgrenze genau bei oder unter 5 %CV lag.

Abbildung 4: Intra- & Intermessvariationsprüfung. Cortisol wurde durchgeführt und die resultierenden Platten wurden zweimal mit jedem Gerät gemessen. (A/A’) Variation zwischen wiederholten Messungen innerhalb eines Geräts sowie die Variation des Mittelwerts von zwei Messungen zwischen beiden Geräten. Abweichung der blank-korrigierten Messungen dargestellt als (A) ΔOD oder (A’) %CV. (B/B’) Vier Standardkurven wurden erstellt und mit jedem Gerät gemessen. (B) Gemessene OD- oder (B’) B/B0-Werte werden gegen bekannte Standardkonzentrationen aufgetragen. (B’-1 bis B’-4) Jede B/B0-Standardkurve wird mit jedem Gerät separat zum Vergleich gezeigt. (C/C’) Variationen der erhaltenen Standardwerte zwischen beiden Geräten werden als (C) ΔOD oder (C’) %CV dargestellt. Boxplot-Daten werden als Box-Whisker-Plot dargestellt. Die Mittellinie zeigt den Median, die Box den Interquartilbereich (IQR) vom ersten bis zum dritten Quartil, die Whiskers +/- 1,5xIQR, und die Punkte zeigen Ausreißer.

Konsistente und zuverlässige Standardkurven sind entscheidend für zuverlässige und aussagekräftige ELISA-Ergebnisse. Die Erstellung von Standardkurven war zwischen Absorbance 96 und PowerWave XS2 vergleichbar (Abb. 3-4, B-C). B/B0-Werte, die das Verhältnis einer Probe zur maximalen Bindungskapazität des Assays bestimmen, sind ein nützliches Metrikwerkzeug zur Analyse kompetitiver ELISA-Assays. Die B/B0-Variationsprüfung wurde durch Messen einer einzelnen Aldosteron-ELISA-Platte in beiden Geräten (Abb. 5) durchgeführt, wobei die B/B0-Werte für jedes Duplikat von Proben bestimmt und die Varianz der erhaltenen B/B0-Werte zwischen den Messungen analysiert wurden, entweder wiederholte Messungen in einem Gerät oder Messungen über verschiedene Geräte hinweg. Die Variation zwischen den erhaltenen B/B0-Werten für alle Proben auf der Platte war sehr gering, und die mit jedem Gerät erhaltenen B/B0-Werte wichen im Durchschnitt nur etwa 1 %CV ab.

Abbildung 5: B/B0 Variationstest. Aldosteron ELISA wurde durchgeführt und die erhaltene Platte in jedem Plattenlesergerät gemessen. B/B0-Werte der Probenduplikate wurden für jeden Messlauf bestimmt. Die Streuung der %CVs von B/B0 wird als (A) %CV zwischen zwei Messungen dargestellt. Boxplot-Daten werden als Box-Whisker-Plot dargestellt. Die Mittellinie zeigt den Median, die Box den Interquartilbereich (IQR) vom ersten bis zum dritten Quartil, die Whiskers +/- 1,5xIQR, und die Punkte zeigen Ausreißer.

Fazit

Diese Studie ergab keine signifikanten Leistungsunterschiede zwischen dem Absorbance 96 ELISA-Reader und konventionellen Tisch-Mikroplatten-Readern. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein kompakter und tragbarer ELISA-Reader, wie der Absorbance 96 ELISA-Reader, eine funktional gleichwertige Alternative zu Tisch-Platten-Readern über ein umfassendes Spektrum von Forschungsanwendungen darstellen kann. Insbesondere zeigt der Absorbance 96 ELISA-Reader eine ausgezeichnete Kompatibilität mit einer breiten Palette von Enzos ELISA-Kits und bietet einen unübertroffenen Nutzen in kleinen oder feldbasierten Laborumgebungen.

Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass der Absorbance 96 ELISA-Reader bei den meisten Tests eine beobachtbar höhere Variation und ein leicht erhöhtes Rauschverhältnis aufwies, obwohl keine statistisch signifikanten Unterschiede gefunden wurden. Folglich werden diese Unterschiede für die überwiegende Mehrheit der praktischen Anwendungen als irrelevant erachtet. Um die Präzision für extrem sensible Daten zu maximieren, können Assays mit dem Absorbance 96 ELISA-Reader anstelle der üblicherweise verwendeten Duplikate in Triplikaten abgelesen werden, insbesondere für Proben mit relativ niedrigen optischen Dichtewerten (OD).

Materialien und experimenteller Überblick

Materialien

PowerWave XS2 (BioTek Instruments), SpectraMax 250 (Molecular Devices), TMB (ADI-90-0350: Enzo Life Sciences), Maus IgG2b-HRP Konjugat (ADI-80-1003: Enzo Life Sciences), IgG2b (Maus), ELISA-Kit (ADI-900-110: Enzo Life Sciences), TNF-α (Maus), ELISA-Kit (ADI-900-047: Enzo Life Sciences), Cortisol ELISA-Kit (ADI-900-071: Enzo Life Sciences), Aldosteron ELISA-Kit (ADI-900-173: Enzo Life Sciences)

Präzisionstest

TMB-Substrat wurde in einem gepoolten Batch durch Mischen mit Maus-IgG2b-HRP-Konjugat entwickelt. Das entwickelte Substrat wurde gleichmäßig auf 80 Wells einer 96-Well-Platte aliquotiert. Die Platte wurde in drei Geräten gemessen: Absorbance 96, PowerWave XS2 & SpectraMax 250, die Ergebnisse wurden gegen ein Blank-Well korrigiert.

Intra- und Intermessvariationsprüfung

IgG2b (Maus), TNF-α (Maus) und Cortisol ELISA wurden gemäß den Herstellerempfehlungen durchgeführt. Die Platten wurden in zwei Geräten gemessen: Absorbance 96 & PowerWave XS2. Duplikate wurden mit derselben Platte gemessen, und die erhaltenen Werte wurden gegen Leerwerte korrigiert.

B/B0-Variationsprüfung

Aldosteron ELISA wurde gemäß den Herstellerempfehlungen durchgeführt. Die Platte wurde mit Absorbance 96, PowerWave XS2 & SpectraMax 250 gemessen. Proben wurden in Duplikaten durchgeführt, und die Platte wurde in allen drei Geräten abgelesen. Danach wurde die Platte ein zweites Mal mit Absorbance 96 & PowerWave XS2 gemessen. Alle Werte wurden NSB-korrigiert.

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