Wichtige Highlights
- Erfolgreiche Prüfung eines kolorimetrischen Tests zur Überwachung der enzymatischen Aktivität von Canavalia-ensiformis-Urease.
- Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Messung der Ureaseaktivität zwischen Absorbance 96 und einem anderen kommerziell erhältlichen Mikroplatten-Lesegerät festgestellt.
- Die Studienergebnisse bestätigen die Fähigkeit von Absorbance 96, die Ureaseaktivität genau zu quantifizieren, und validieren ihr Potenzial als robustes Werkzeug.
Einführung
Die Kolorimetrie ist eine der am häufigsten angewendeten analytisch-chemischen Techniken (1), die es ermöglicht, die Konzentration einer Verbindung in einer Lösung oder die Aktivität eines spezifischen Enzyms durch Messung der spektralen Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge zu bestimmen (2). Kolorimetrische Assays werden üblicherweise mit einem Kolorimeter durchgeführt (Spektrophotometer oder Mikroplatten-Lesegerät), das typischerweise die Änderung der Absorptionswerte (3) der gebildeten oder umstrukturierten farbigen Verbindung während der Messung misst. Kolorimetrische Assays bieten viele Vorteile, wie einfache Analyseverfahren, leichte und weniger zeitaufwändige Protokolle und geringere Kosten (4). Mit den Fortschritten in der Entwicklung empfindlicher Kolorimeter und zusätzlicher Reagenzien sind kolorimetrische Assays zu einigen der am weitesten verbreiteten Methoden in verschiedenen Forschungsanwendungen geworden.
Beispielsweise basieren Urease-Aktivitätsmessungen auf der in einer Probe produzierten Ammoniak-Konzentration. Traditionell wurde der Assay, der auf der Nessler-Methode basiert, üblicherweise zur Bestimmung der Urease-Aktivität angewendet. Dieser Assay erforderte jedoch toxische, quecksilberhaltige Reagenzien und umfasste arbeitsintensive und unwirtschaftliche Prozesse. Um die Gefahren der Nessler-Methode zu überwinden, werden neue quantitative kolorimetrische Assays entwickelt, die Berichten zufolge genauso empfindlich sind wie die traditionellen Methoden (5–7). Einige davon verwenden Prinzipien wie die im Stuart-Urease-Test angewendeten, die auf der Messung der Farbänderung aufgrund der Alkalisierung des Mediums basieren, die durch das Urease-Enzym katalysiert wird, unter Verwendung von Phenolrot als Indikator.
In diesem Anwendungshinweis wurde eine vergleichende Studie zwischen Absorbance 96 und SpectraMax iD3 durchgeführt, um die Urease-Aktivität zu messen und zu überwachen. Eine neuartige und etablierte kolorimetrische Assay-Methode, entwickelt von Okyay und Rodriguez et al., wurde verwendet, um die enzymatische Aktivität von Canavalia ensiformis Urease (auch bekannt als Jackbohne) zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass das Mikroplatten-Lesegerät Absorbance 96 gut für die Stuart-Urease-Testmethode geeignet ist und seine Messfähigkeit mit anderen Mikroplatten-Lesegeräten auf dem Markt vergleichbar ist. Zusätzlich unterstrichen diese Ergebnisse die Wirksamkeit solcher kolorimetrischen Assays bei der Bewertung der Urease-Aktivität.
Sehen Sie Absorbance 96 in Aktion
Ergebnisse
Absorbance 96 misst die Ureaseaktivität effektiv
Die Ureaseaktivität ist proportional zur Farbänderungsrate von Phenolrot, die durch Messung der Absorption über einen bestimmten Zeitraum bestimmt wird. Daher wurden Absorptionsmessungen mit Absorbance 96 und SpectraMax iD3 Mikroplatten-Lesegeräten zum Vergleich durchgeführt. Nach Überwachung der Absorptionskinetik einer Verdünnungsreihe von Canavalia ensiformis-Urease mit jedem Mikroplatten-Lesegerät wurden Standardkurven erstellt, die die Farbänderungsrate als Funktion der Canavalia ensiformis-Urease-Enzymaktivität ausdrücken (Abb. 1 stellt die Messungen an Absorbance 96 dar und Abb. 2 die Messungen an SpectraMax iD3). Die in beiden Standardkurven erhaltenen Ergebnisse zeigten ein hohes Maß an Ähnlichkeit. Zusätzlich übertraf der Bestimmtheitskoeffizient (R2) beim Vergleich der Anpassungskurven in beiden Fällen 0,99, was darauf hindeutet, dass sich die Kalibrierkurven hinsichtlich der Linearität der Messung nicht unterscheiden. In der Kurvengleichung bezieht sich 'y' auf die Rate der Farbänderung und 'x' auf die Ureaseaktivität der Canavalia ensiformis-Proben, und die Gleichung wird verwendet, um den Wert der Ureaseaktivität zu berechnen.
Basierend auf den hochgradig konsistenten Ergebnissen, die zwischen den beiden unterschiedlichen Standardkurven, die mit verschiedenen Mikroplatten-Lesegeräten erzeugt wurden, beobachtet wurden, kann gefolgert werden, dass die Verwendung von Absorbance 96 zur Quantifizierung der Ureaseaktivität ebenso geeignet ist wie das Mikroplatten-Lesegerät SpectraMax iD3. Da für die Absorptionsmessung mit Absorbance 96 und SpectraMax iD3 zwei verschiedene 96-Well-Platten mit unterschiedlichen Proben verwendet wurden, können diese Standardkurven nur relativ, nicht absolut verglichen werden.
Diskussion
Nach dem Vergleich der Messungen und der anschließenden Bestimmung der Standardkurve zur Untersuchung der enzymatischen Aktivität von Canavalia ensiformis Urease zeigten die Messungen mit Absorbance 96 eine Linearität in den Daten, die gut mit dem erwarteten Ergebnis bei SpectraMax iD3 übereinstimmt. Daher liefert diese Studie überzeugende Beweise, die den effektiven Einsatz des Mikroplatten-Lesegeräts Absorbance 96 zur Durchführung kolorimetrischer Urease-Aktivitätstests unterstützen.
Zusätzlich deutet diese Studie darauf hin, dass die von Okyay und Rodriguez et al. entwickelte kolorimetrische Methode eine effektive Alternative für den Nachweis der Ureaseaktivität sein könnte, wodurch möglicherweise die Notwendigkeit entfällt, toxische Reagenzien in zukünftigen Untersuchungen zu handhaben. Darüber hinaus stellen die wirtschaftlichen Vorteile, die mit der Zugänglichkeit und Kosteneffizienz leicht verfügbarer kolorimetrischer Reagenzien verbunden sind, einen erheblichen Vorteil dar.
Materialien und Versuchsaufbau
Kolorimetrischer Test zur schnellen Quantifizierung der Ureaseaktivität
Zur Messung der Urease-Enzymaktivität wurde ein experimentelles Protokoll unter Verwendung von Phenolrot als kolorimetrischem Indikator durchgeführt (4). Die Proben von Canavalia ensiformis Urease wurden in Stuarts Urease-Bouillon-Medium hergestellt, um Urease-positive und Urease-negative Bakterien zu unterscheiden (8,9). Dieses Medium enthielt Phenolrot, einen pH-Indikator, der sich je nach Alkalisierung des Mediums von gelb-orange nach pink-rot verfärbt. Der Mechanismus von Stuarts Bouillon basiert auf der Hydrolysereaktion, die durch das Urease-Enzym katalysiert wird. Bakterien, die Harnstoff hydrolysieren können, können ausreichend basisches Ammoniak und Kohlendioxid als Nebenprodukte produzieren. Das produzierte Ammoniak protoniert weiter zu Ammonium- und Hydroxylionen, was zu einer Alkalität des Mediums führt und somit den pH-Wert des Mediums erhöht und die kolorimetrische Verschiebung von Phenolrot induziert. Diese Farbänderungsrate (h–1) kann durch die Differenz der in den Proben detektierten Absorption gemessen werden und ist direkt proportional zur Ureaseaktivität (6, 9,8). Daher kann man die Ureaseaktivitätsrate nach folgender Gleichung berechnen: Rate = (Absorption bei t2 - Absorption bei t1)/(t2-t1), wobei t1 und t2 zwei verschiedene Zeitpunkte sind, an denen unterschiedliche Absorptionsmessungen vorgenommen wurden.
Probenvorbereitung und kinetische Absorptionsmessung
Um die Fähigkeiten von Absorbance 96 und SpectraMax iD3 Mikroplatten-Lesegerät zu vergleichen, wurde zunächst eine Verdünnungsreihe von Canavalia ensiformis (Urease, Canavalia Ensiformis, 10 kU, Calbiochem) hergestellt. Dazu wurden 20 µl/Well der jeweiligen Urease-Verdünnung in zwei 96-Well-Mikroplatten (MTP) (Greiner Bio-one, Frickenhausen) vorab geladen und 180 µl Stuart-Bouillon/Well hinzugefügt. Nach 3 Sekunden manuellem Rühren wurde eine der 96-Well-Mikroplatten in das Absorbance 96 Mikroplatten-Lesegerät eingesetzt, und die Absorption wurde über 250 Minuten in Intervallen von 30 Sekunden gemessen. Das gleiche Verfahren wurde sofort für die Absorptionsmessung mit dem SpectraMax iD3 angewendet.
Referenzen
1. Cooper JA, Mintz BR, Palumbo SL, Li WJ. Assays for determining cell differentiation in biomaterials. Charact Biomater. 2013 Jan 1;101–37.
2. Askim JR, Suslick KS. Colorimetric and fluorometric sensor arrays for molecular recognition. Compr Supramol Chem II. 2017 Jan 1;8:37–88.
3. Na HJ, Chung HT, Ha KS, Lee H, Kwon YG, Billiar TR, Kim YM. Chapter 17 Detection and measurement for the modification and inactivation of caspase by nitrosative stress in Vitro and in Vivo. Methods Enzymol. 2008, 441, 317–327.
4. Catherine EH, Edwin CC. Chemistry, An Introduction to Organic, Inorganic and Physical Chemistry: Google Libros.
5. Bzura J, Koncki R. A Mechanized Urease Activity Assay. Enzyme Microb. Technol. 2019, 123, 1–7.
6. Onal OT, Frigi RD. High Throughput Colorimetric Assay for Rapid Urease Activity Quantification. J. Microbiol. Methods 2013, 95 (3), 324–326.
7. Kandeler E, Gerber H. Short-Term Assay of Soil Urease Activity Using Colorimetric Determination of Ammonium. Biol. Fertil. Soils 1988, 6 (1), 68–72.
8. Brink B. Urease Test Protocol - Library Urease Test Protocol Author Information Urease Test Protocol - Library www.asmscience.org.
9. Cui MJ, Teng A, Chu J, Cao B. A Quantitative, High-Throughput Urease Activity Assay for Comparison and Rapid Screening of Ureolytic Bacteria. Environ. Res. 2022, 208, 112738.
