Wichtigste Ergebnisse
- Die mit Absorbance 96 ermittelten OD-Werte waren nahezu identisch mit denen eines anderen handelsüblichen Plattenlesegeräts.
- Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen die Robustheit und Zuverlässigkeit des Absorbance 96 bei der Messung des Bakterienwachstums.
- Das kompakte Design des Absorbance 96 bietet Vorteile, wie die Möglichkeit, OD-Messungen vor Ort durchzuführen, was die Laboreffizienz und Produktivität erhöht.
Einleitung
Messungen des Bakterienwachstums sind in vielen Forschungsbereichen, einschließlich Fermentation, Antibiotika-Wirksamkeit, synthetischer Biologie und der Lebensmittelindustrie, von entscheidender Bedeutung. Die Einschätzung des Bakterienwachstums gibt Aufschluss über die Dynamik der Bakterienpopulation, ihre Wachstumsrate und Aktivität sowie die Auswirkungen von Umweltbedingungen auf diese Prozesse. Das Verständnis der Wachstumsrate ermöglicht es, optimale Bedingungen für die Bakterienproliferation zu bestimmen und den Ertrag gewünschter Produkte wie Metaboliten und rekombinanter Proteine in biotechnologischen Anwendungen zu maximieren. Darüber hinaus erleichtert die Untersuchung der zugrunde liegenden Faktoren, die das Bakterienwachstum beeinflussen, die Entwicklung gezielter Strategien zur Kontrolle und Hemmung der Bakterienproliferation, insbesondere im Fall pathogener Bakterien.
Es gibt verschiedene Methoden zur Quantifizierung des Bakterienwachstums. Die Messung der optischen Dichte (OD) ist die gebräuchlichste und einfachste Methode zur Messung des Bakterienwachstums. Die OD-Messung basiert auf der Lichtstreuung, wenn ein Lichtstrahl (normalerweise bei 600 nm) durch die Bakterienprobe geleitet wird. Je mehr Bakterien in der Probe vorhanden sind, desto mehr Licht streuen sie. Daher schätzt die Methode die Anzahl der Bakterien in einer Probe. Mit zunehmender Bakterienzahl steigt auch der OD600-Wert (1,2).
Diese Applikationsschrift zeigt, wie der Absorbance 96 Plattenleser bei der Bestimmung von OD600-Messungen hilft. In Zusammenarbeit mit der Hochschule München wurde eine vergleichende Analyse des Absorbance 96 mit einem anderen Spektrophotometer und einem anderen Mikroplattenleser durchgeführt, um das bakterielle Wachstum eines ureolytischen Bakteriums, Sporosarcina pasteurii, zu überwachen, das für seine einzigartige Fähigkeit zur mikrobiell induzierten Kalzitausfällung (MICP) bekannt ist, die im Bauwesen und bei Materialanwendungen benötigt wird (3). Die mit dem Absorbance 96 erhaltenen OD-Werte sind mit denen anderer handelsüblicher Plattenleser vergleichbar, was die Zuverlässigkeit und Effizienz des Absorbance 96 für OD-Messungen bestätigt. Der geringe Platzbedarf des Absorbance 96 bietet jedoch einen erheblichen Vorteil gegenüber anderen traditionellen, großen Plattenlesern, da er Flexibilität bietet und den Arbeitsablauf in jedem Labor, insbesondere bei Außeneinsätzen, verbessert.
Ergebnisse
Absorbance 96 und SpectraMax iD3 Plattenleser zeigten identische OD-Werte
Bakterienwachstum kann durch den Zugriff auf die optischen Dichten der Proben quantifiziert werden. Daher wurden Absorptionsmessungen mit dem Absorbance 96 und dem SpectraMax iD3 Mikroplattenleser durchgeführt, um das Bakterienwachstum zu untersuchen und deren Messgenauigkeit zu vergleichen. Dreifache OD-Messungen der Verdünnungsreihe von Sporosarcina pasteurii in einer 96-Well-Mikroplatte wurden bei 605 nm zuerst mit dem SpectraMax iD3 durchgeführt. Anschließend wurde dieselbe Mikroplatte mit dem Absorbance 96 gemessen. Die erhaltenen OD605-Werte beider Geräte waren praktisch identisch und zeigten keine signifikanten Unterschiede in den Messungen (T-Test: p-Wert > 0,005, (0,744)).
Diese Ergebnisse führen zu zwei wichtigen Schlussfolgerungen. Erstens werden Plattenleser, die einen ähnlichen optischen Aufbau verwenden, wahrscheinlich ähnliche Messwerte liefern. Zweitens liefert Absorbance 96 trotz seiner kompakten Größe Ergebnisse, die denen des SpectraMax iD3 vergleichbar sind. Dies bestätigt, dass Absorbance 96 eine hohe Leistung bei der Messwertablesung aufweist, ähnlich der anderer etablierter Mikroplattenleser auf dem Markt.
Photometermessungen ergaben höhere OD-Werte
Die Messung der optischen Dichte der Bakterienproben bei 605 nm mit dem Photometer BioMate 3 zeigte im Vergleich zu den Werten der Plattenleser (SpectraMax iD3 und Absorbance 96) leicht höhere OD605-Werte (Abb. 1). Dieser Unterschied im Absolutwert der vom Photometer gemessenen OD605 könnte durch die Art und Weise erklärt werden, wie der Lichtstrahl in die Proben geleitet wird. Der Lichtstrahl passiert die Küvetten in Photometern horizontal, und die Weglänge ist normalerweise auf 1 cm standardisiert. In Plattenlesern hingegen passiert der Lichtstrahl die Wells vertikal, und diese Ausrichtung erzeugt Variablen, die berücksichtigt werden müssen. In diesem Fall bestimmt das Volumen in den Wells die Weglänge (4).
Zusammenfassung
In diesem Application Note wurden die OD-Messungen, die mit dem Absorbance 96 Plattenleser im Vergleich zu zwei handelsüblichen Geräten (dem BioMate 3 Photometer und dem SpectraMax iD3 Plattenleser) gewonnen wurden, untersucht. Das BioMate 3 zeigte relativ höhere OD605-Werte im Vergleich zu beiden Plattenlesern, was durch den Unterschied in der Weglänge erklärt werden kann. Die OD605-Ergebnisse, die mit dem Absorbance 96 und dem SpectraMax iD3 (Plattenleser) erzielt wurden, waren jedoch praktisch identisch, was darauf hindeutet, dass der Absorbance 96 das Bakterienwachstum ebenso effektiv messen kann wie jeder andere Plattenleser.
Betrachtet man den Arbeitsablauf für OD600-Messungen, bietet der Absorbance 96 zusätzliche Vorteile gegenüber anderen kommerziell erhältlichen Geräten auf dem Markt. Beispielsweise ermöglicht die kompakte Größe des Absorbance 96 eine einfache Mobilität, die eine OD600-Messung direkt am Arbeitsplatz (z.B. Fermenter, anaerobe Kammern) ohne Probentransport zu anderen Standorten mit Plattenlesern ermöglicht.
Materialien und experimenteller Aufbau
Um die Effektivität des Absorbance 96 zur Messung des Bakterienwachstums zu bewerten, wurden OD-Messungen für Sporosarcina pasteurii in verschiedenen Spektrophotometergeräten durchgeführt und die erhaltenen Messwerte verglichen.
Zuerst wurde eine Bakterienkultur von Sporosarcina pasteurii (erhalten von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen; DSMZ) hergestellt, indem sie über Nacht in 20 mL Casomedium (Merck 105458) ergänzt mit 4 mL Harnstoff (20g/L) bei 30°C und 200 rpm kultiviert wurde. Am folgenden Tag wurde die Bakterienkultur verdünnt (1:10), und eine Reihe von Verdünnungen (0%, 10%, 25%, 40%, 55%, 70%, 85%, 100%) von 10 mL wurden in einem Casomedium vorbereitet. Zum Vergleich wurde zuerst die OD mit dem BioMate 3 Photometer (Thermo Fisher Scientific) bei 605 nm (OD605) in Dreifachbestimmung gemessen, indem 1 mL der Bakterienkulturprobe in Semi-Mikroküvetten (LabSolute) inkubiert wurde. Hier wurde der Blank durch Einstellung auf 0% bestimmt. Als Nächstes wurde eine 96-Well-Mikroplatte mit den verschiedenen Verdünnungsreihenproben (oben erwähnt) inkubiert, und die OD wurde mit dem SpectraMax iD3 (Molecular Devices) Mikroplattenleser ohne Deckel bei 605 nm in Dreifachbestimmung gemessen. Anschließend wurde dieselbe 96-Well-Mikroplatte (ohne Schütteln) verwendet, um die OD mit dem Absorbance 96 zu messen.
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Referenzen
1. Mandelstam J, McQuillen K, Dawes, IW. Biochemie des Bakterienwachstums.1982, 449.
2. Stevenson K, McVey AF, Clark IBN, Swain P. S, Pilizota, T. Allgemeine Kalibrierung des mikrobiellen Wachstums in Mikroplattenlesern. Sci. Reports 2016 61 2016, 6 (1), 1–7.
3. Ma L, Pang AP, Luo Y, Lu X, Lin F. Nützliche Faktoren für die Biomineralisation durch das ureolytische Bakterium Sporosarcina pasteurii. Microb Cell Fact. 2020 Jan 23;19(1).
4. Beer. Bestimmung der Absorption des roten Lichts in farbigen Flüssigkeiten. Ann. Phys. 1852, 162 (5), 78–88.
