Zytotoxizitätsassays sind in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung, der Wirkstoffentdeckung und der Toxikologie unverzichtbar. Sie helfen, die Lebensfähigkeit und den Tod von Zellen als Reaktion auf chemische, umweltbedingte oder biologische Stimuli zu beurteilen. Diese Assays sind besonders nützlich, um die toxischen Wirkungen neuer Arzneimittelkandidaten, Umweltgifte oder anderer Behandlungen auf zelluläre Systeme zu bestimmen. Lumineszenzbasierte Assays, wie der CytoTox-Glo®-Assay, bieten eine hohe Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit, weshalb sie in großem Umfang für Zytotoxizitätsmessungen eingesetzt werden.
Automatisierung von Lumineszenzassays mit integrierter Lumineszenz-Auslesung auf einem Liquid-Handling-System
Die Automatisierung von Zytotoxizitätsassays rationalisiert den Arbeitsablauf (Abb. 1), indem sie eine präzise, automatisierte Dosierung von Reagenzien und Proben sowie eine Echtzeit-Lumineszenzdetektion ermöglicht. Diese Integration verbessert die Datenreproduzierbarkeit erheblich, indem manuelle Handhabungsfehler minimiert und die Variabilität reduziert werden. Die hohe Durchsatzfähigkeit, die die gleichzeitige Verarbeitung von bis zu 96 Proben ermöglicht, ist besonders vorteilhaft für groß angelegte Zytotoxizitäts-Screenings. Diese Workflow-Lösung ist ein unschätzbares Werkzeug für Forscher in der Wirkstoffforschung und Zellbiologie, wo Effizienz und Zuverlässigkeit entscheidend sind.
Bei der Auswahl eines Lumineszenz-Readers sind Sensitivität, die die Erkennung niedriger Signalspektren gewährleistet, und Crosstalk wichtige Faktoren; reduzierter Crosstalk ermöglicht eine genaue Messung über verschiedene Proben in der Mikrotiterplatte hinweg. Diese Studie bewertete die Leistung und Zuverlässigkeit des Luminescence 96 Automate für automatisierte Lumineszenzassays und dessen Integration in das epMotion® Liquid-Handling-System. Die Leistung wurde anhand eines eigenständigen Plattenlesers eines Wettbewerbers verglichen, wobei die Effektivität bei der Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit und Zytotoxizität mit dem CytoTox-Glo® Assay von Promega verglichen wurde. Ziel war es, einen automatisierten Workflow zu etablieren, der Präzision und Effizienz bei Hochdurchsatz-Lumineszenzassays verbessert.
Ergebnisse
Nahtlose Integration: Automatisierung des CytoTox-Glo® Zytotoxizitätsassays mit Luminescence 96 Automate und epMotion®
Ein automatisierter CytoTox-Glo® Zytotoxizitätsassay wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt, um die Integration des Luminescence 96 Automate in das epMotion® Liquid-Handling-System zu validieren. Der CytoTox-Glo® Assay von Promega misst den Zelltod durch den Nachweis von Proteaseaktivität, die von Zellen mit geschädigten Membranen freigesetzt wird.
Durch Zugabe von 10 µl des Kinaseinhibitors Staurosporin zur Mikrotiterplatte wurde dessen zytotoxische Wirkung auf die Zellen induziert. Nach dem CytoTox-Glo® Kit-Protokoll wurde das lumineszierende Signal (Glow-Typ) von toten Zellen zunächst mit Luminescence 96 Automate mit einer Integrationszeit von 0,3 Sekunden gemessen. Anschließend, nach Zugabe des Lyse-Reagenzes, wurde das lumineszierende Signal, das mit der Gesamtzellzahl verbunden ist, bei gleicher Integrationszeit gemessen. Durch Subtraktion des lumineszierenden Signals, das aus dem experimentellen Zelltod resultierte, von den gesamten lumineszierenden Werten wurde die Viabilität (lumineszierendes Signal von lebenden Zellen) berechnet. Zusätzlich wurden für eine umfassende vergleichende Analyse auch Signale mit dem eigenständigen Mikrotiterplattenleser eines Konkurrenten gemessen.
Die Ergebnisse (Abb. 2) zeigen vergleichbare Lumineszenzsignalprofile zwischen dem Luminescence 96 Automate und dem eigenständigen Mikrotiterplattenleser eines Wettbewerbers.
Zusätzlich zeigte die halbmaximale effektive Konzentration (EC50) von Staurosporin, bestimmt mittels eines Regressionsmodells, das an eine sigmoide Kurve angepasst wurde, konsistente Werte unter Verwendung des integrierten und des eigenständigen Lumineszenzlesers (Abb. 3) sowohl für lebende als auch für tote Zellen (Abb. 3). 
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Luminescence 96 Automate die Zelllebensfähigkeit und Zytotoxizität effektiv quantifiziert und Daten liefert, die mit denen eines anderen Lumineszenz-Mikrotiterplattenlesers vergleichbar sind. Wichtig ist, dass die Integration in das epMotion®-System automatisierte und sofortige Messwerte ohne Benutzereingriff ermöglicht.
Fazit
Der vergleichende Analyse des Luminescence 96 Automate mit einem eigenständigen Mikrotiterplattenleser eines Wettbewerbers bestätigte eine konsistente Quantifizierung der Zellzytotoxizität, was durch ähnliche EC50-Werte über alle experimentellen Bedingungen hinweg hervorgehoben wurde. Besonders hervorzuheben ist die nahtlose Integration in das epMotion® Liquid-Handling-System, die automatisierte, sofortige Messwerte ohne Benutzereingriff ermöglicht und es von traditionellen eigenständigen Plattenlesern mit Integrationsschwierigkeiten für die Laborautomation abhebt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der etablierte CytoTox-Glo®-Workflow die automatisierte Lumineszenz-Plattenablesung erheblich vorantreibt und Forschern ein leistungsstarkes Werkzeug zur Durchführung präziser, hochdurchsatzfähiger zellulärer Lumineszenz-Assays mit Zuversicht und Effizienz bietet.
