Wichtigste Highlights
- Absorbance 96 ist ein robuster und effektiver Mikroplatten-Reader zur Durchführung von XTT-Zellviabilitätstests.
- Die Integration von 96 Detektionseinheiten in Absorbance 96 ermöglicht eine schnelle und simultane Messung aller Wells – vorteilhaft für zeitkritische, zellbasierte kinetische Studien.
- Die Verwendung von gebrauchsfertigen Zellen aus dem instaCELL® Kit reduziert die Variabilität und erhöht die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des XTT-Tests.
Einleitung
Zellbasierte Modelle haben sich in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen, einschliesslich der Grundlagenforschung, der Zielprüfung und der Arzneimittelentwicklung, als unverzichtbare und etablierte Werkzeuge erwiesen (1). Insbesondere im Pharmasektor haben diese zellbasierten Assays an Bedeutung gewonnen. Zum Beispiel bieten zellbasierte Assays in der Toxikologie eine vielversprechende Alternative zu Tierversuchen und -experimenten (2). Bei GLP/GMP-Tests ist die Anforderung an die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zellbasierter Assays von besonderer Bedeutung, wobei die Anwendung von assay-ready Zellen als sehr vorteilhaft erweist. Diese Zellen stehen sofort für Experimente zur Verfügung, sodass keine vorherige Kultivierung erforderlich ist, und können direkt als Reagenzien in verschiedenen Assays eingesetzt werden.
Einer der am weitesten verbreiteten zellbasierten Assays ist der XTT-Assay, der die Quantifizierung der zellulären Stoffwechselaktivität ermöglicht und als zuverlässiger Indikator für Zellviabilität, Proliferation und Zytotoxizität dient. Dieser kolorimetrische Assay basiert auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumsalzes (Natrium-3-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)benzolsulfonsäurehydrat oder XTT) durch metabolisch aktive Zellen. Der Reduktionsprozess erzeugt einen orangefarbenen Formazanfarbstoff, der in wässriger Lösung löslich bleibt und direkt mit einem Mikroplatten-Reader gemessen werden kann (3, 4). Mit zunehmender Anzahl lebensfähiger Zellen nimmt auch die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase in der Probe zu, was zu einer proportionalen Zunahme der orangefarbenen Formazanbildung führt. Und dieses Phänomen kann durch Messung der Absorptionswerte genau überwacht werden.
Diese Applikationsschrift zielt darauf ab, die Validierung von Absorbance 96 als geeigneten Mikroplatten-Reader zur Durchführung von XTT-Zellviabilitätstests mit dem instaCELL® Zytotoxizitäts-Kit (SF020-02, acCELLerate) vorzustellen. Das Kit enthält alle notwendigen Reagenzien (gebrauchsfertige L-929-Zellen, Erholungspuffer, Assay-Medium, Assay-Platten, XTT-Viabilitäts-Assay-Reagenz und geeignete Positiv- und Negativkontrollen) zur Durchführung des XTT-Assays. Die erzielten Ergebnisse verdeutlichen den durch das instaCELL® Zytotoxizitäts-Kit und die kinetische Messfunktion des Absorbance 96 Mikroplatten-Readers ermöglichten optimierten XTT-Assay-Workflow. Diese Studie wurde in Zusammenarbeit mit acCELLerate GmbH durchgeführt.
Ergebnisse
Es wurde eine umfassende Reihe von Tests durchgeführt, um kritische Parameter zu bewerten, die für zellbasierte Assay-Workflows unerlässlich sind, um die Eignung des Absorbance 96 Mikroplatten-Readers für solche Assays zu beurteilen. Diese Studie konzentrierte sich speziell auf den XTT-Zellviabilitätstest. Sie umfasste die Bewertung von Faktoren wie der Well-to-Well-Variabilität und der Messgenauigkeit von Absorbance 96 für den XTT-Test.
Bestimmung der Well-to-Well-Variabilität
Absorbance 96 ist ein Festkörper-Mikroplatten-Reader, der mit 96 Detektionseinheiten ausgestattet ist und die gleichzeitige Messung der Absorptionswerte aller 96 Wells bei der Durchführung von XTT-Assays oder anderen kolorimetrischen Methoden ermöglicht. Aufgrund dieser einzigartigen optischen Anordnung ist die Bewertung der Messgenauigkeit und Variabilität über die gesamte 96-Well-Platte hinweg von entscheidender Bedeutung. Um dies zu testen, wurden 30.000 L-929-Zellen in jedes Well einer 96-Well-Platte ausgesät und kultiviert. Die Zellen wurden dann 24 Stunden lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert. Anschliessend wurde Tetrazoliumsalz (XTT) zu den Zellen gegeben. Um den Einfluss von Zellkulturbedingungen und Zellgrösse auf die Absorptionsmessung zu minimieren, wurde der resultierende Überstand aus allen 96 Wells gepoolt und in eine neue 96-Well-Platte überführt (5). Die Platte wurde dann in den Absorbance 96 eingesetzt und die optische Dichte (OD) bei 492 nm gemessen (Abb. 1).
Die Ergebnisse zeigen eine gleichmässige Verteilung der Absorptionsmessung über die 96-Well-Platte, mit einer signifikant geringen Standardabweichung (SD) von 1,2 %. Dies liegt gut im erwarteten Bereich für zellbasierte Assays, unter Berücksichtigung inhärenter Faktoren, die die Variabilität in verschiedenen Wells beeinflussen könnten, wie die Anzahl und Wachstumsbedingungen der Zellen pro Well oder Randeffekte (6). Es wurden auch keine Ausreisser festgestellt, was konsistente Absorptionsmessungen und eine geringe Well-to-Well-Detektionsvariabilität im Absorbance 96 für die Messung der Absorptionskinetik über die gesamte 96-Well-Platte hinweg bedeutet. Eine genaue Messung in einem zellbasierten Assay ist entscheidend, insbesondere bei der Anwendung verschiedener experimenteller Bedingungen und dem Aussäen von Zellen in einer 96-Well-Platte. Die Minimierung der Well-to-Well-Variabilität wird entscheidend, um die Messgenauigkeit zu verbessern.
Messung der XTT-Assay-Kinetik
Vor der Durchführung weiterer Evaluierungsschritte war die Bestimmung der optimalen Zelldichte entscheidend, um die Validität des XTT-Assays und die Messgenauigkeit zu gewährleisten. Daher wurden L-929-Zellen in einer 96-Well-Platte in verschiedenen Dichten von 1.000 bis 100.000 Zellen pro Well ausgesät. Anschliessend wurden die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um die Adhäsion zu fördern. Nach der Inkubationszeit wurde XTT hinzugefügt, um die Stoffwechselaktivität der Zellen zu quantifizieren. Die Platte wurde dann in den Absorbance 96 eingesetzt, und die Absorptionskinetik wurde über 4 Stunden überwacht, um die optimale Inkubationszeit und Zelldichte für den XTT-Assay zu bestimmen (Abb. 2). 3E+04 Zellen wurden pro Well gewählt, da sie das beste Signal-Rausch-Verhältnis mit einer gleichzeitig nahezu linearen Steigung über den gesamten Inkubationszeitraum aufwiesen.
Bewertung der XTT-Assay-Genauigkeit
Ordnungsgemäss standardisierte Zellkulturprotokolle und -verfahren sind für eine reproduzierbare und routinemässige Zellverwendung unerlässlich. Um die Variationen und Diskrepanzen im Zusammenhang mit Zellkulturergebnissen zu minimieren, hat sich die Verwendung von gebrauchsfertigen Zellen als wertvoller Ansatz erwiesen. Gebrauchsfertige Zellen werden mit hoher Viabilität und in funktionsfähigem Zustand kryokonserviert, was ihre direkte Verwendung in Assays ohne vorherige Kultivierung ermöglicht und somit die Variabilität aufgrund von Kulturprotokollen minimiert.
Um die Genauigkeit des XTT-Assays zu untersuchen, wurde eine dosisabhängige Antwortkurve unter Verwendung von Natriumselenit, einer toxischen Referenzverbindung, erstellt. Studien haben gezeigt, dass Natriumselenit den Zelltod und die Apoptose durch die Produktion von Superoxid in Mitochondrien und die Aktivierung des mitochondrialen apoptotischen Signalwegs induziert (7). Dazu wurden gebrauchsfertige L-929-Zellen in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut, und die Zellsuspension wurde dann in 8 ml vorgewärmtes RPMI-Medium überführt. Anschliessend wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 80 x g für 3 Minuten pelletiert, was dann in 10 ml Assay-Medium (RPMI 1640, 20 % fötales Rinderserum, 2 mM L-Gln) resuspendiert wurde. Danach wurden 20.000 Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte ausgesät. Um die Reaktion der Zellen auf unterschiedliche Natriumselenit-Konzentrationen zu bewerten, wurden vier Sätze von Reihenverdünnungen (75 %, 100 %, 125 % und 150 %) der nominalen Konzentration hergestellt und zu den Zellen gegeben und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde XTT zu den Zellen gegeben und 4 Stunden lang inkubiert. Die Stoffwechselaktivität, die die Zellviabilität anzeigt, wurde dann durch Messung der Absorption bei 492 nm mit Absorbance 96 bestimmt (Abb. 3).
Der IC50-Wert wurde für jeden der vier Verdünnungssätze berechnet (Tabelle 1). Die IC50-Werte stimmten eng mit den berechneten Konzentrationen der Verdünnungen überein, wodurch die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Assay-Methode validiert wurde. Diese Ergebnisse unterstreichen die Eignung von Absorbance 96 als zuverlässigen Mikroplatten-Reader zur Durchführung zellbasierter Assays wie dem XTT-Assay.
Diskussion
Der XTT-Assay ist eine wertvolle Methode zur Untersuchung von Veränderungen der Zellzahl und Stoffwechselaktivität, die Einblicke in Zellviabilität, Proliferation und Zytotoxizität gibt. Die in dieser Anwendungsschrift erhaltenen Ergebnisse bestätigen die Effektivität und Genauigkeit von Absorbance 96 für die Durchführung eines XTT-Assays. Mit seinem Design, das 96 Detektionseinheiten umfasst, ermöglicht Absorbance 96 eine schnelle Auslesung aller Wells in einer 96-Well-Mikroplatte, wodurch schnelle Messungen der Absorptionskinetik der Proben möglich sind. Darüber hinaus zeigt Absorbance 96 die Fähigkeit, die XTT-Metabolisierung über einen Bereich von Zelldichten, von 1.000 bis 100.000 Zellen, genau zu detektieren, was seine Eignung für verschiedene zellbasierte Assays unterstreicht. Der Bedarf an umfassender Zellkulturmanipulation und komplexen Aufbauten, die mit anderen Mikroplatten-Readern verbunden sind, kann Variabilität einführen und die Ergebnisse zellbasierter Assays negativ beeinflussen. Die gebrauchsfertigen Zellen, die mit dem instaCELL® Zytotoxizitäts-Kit geliefert werden, kombiniert mit Absorbance 96, bieten jedoch einen benutzerfreundlichen Workflow für die Durchführung präziser XTT-Assays.
Referenzen
1. Hirsch C, Schildknecht S. In vitro research reproducibility: Keeping up high standards. Front Pharmacol. 2019 Dec 10;10:492837.
2. Zink D, Chuah JKC, Ying JY. Assessing Toxicity with Human Cell-Based In Vitro Methods. Trends Mol Med. 2020 Jun 1;26(6):570–82.
3. Paull KD, Shoemaker RH, Boyd MR, Parsons JL, Risbood PA, Barbera WA, et al. The synthesis of XTT: A new tetrazolium reagent that is bioreducible to a water-soluble formazan. J Heterocycl Chem1988 May 1;25(3):911–4.
4. Talekar M, Kendall J, Denny W, Jamieson S, Garg S. Development and evaluation of PIK75 nanosuspension, a phosphatidylinositol- 3-kinase inhibitor. Eur J Pharm Sci. 2012 Dec 18;47(5):824–33.
5. Stevenson K, McVey AF, Clark IBN, Swain PS, Pilizota T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Sci Reports 2016.
6. Mansoury M, Hamed M, Karmustaji R, Al Hannan F, Safrany ST. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Reports. 2021 Jul 1;26:100987.
7. Xiang N, Zhao R, Zhong W. Sodium selenite induces apoptosis by generation of superoxide via the mitochondrial-dependent pathway in human prostate cancer cells. Cancer Chemother Pharmacol. 2009 Jan;63(2):351–62.
