Wichtige Highlights
- Eine vergleichende Bewertung des Absorbance 96 Automate mit einem anderen Tisch-Mikroplatten-Reader zeigte identische Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit und Linearität innerhalb des dynamischen Bereichs.
- Die On-Deck-Integration des Absorbance 96 Automate in das epMotion® Liquid-Handling-System automatisiert den BCA-Assay und spart den Benutzern Zeit bei Experimenten.
- Die Integration des Absorbance 96 Automate in einen automatisierten Workflow ermöglicht das direkte Auslesen von Platten ohne Benutzereingriff.
Einleitung
Die Quantifizierung der Proteinkonzentration in wässrigen Proben ist ein wichtiger Test, der routinemäßig in zahlreichen Laboren durchgeführt wird, von der Grundlagenforschung bis zu klinischen Forschungsanwendungen. Die Proteinkonzentrationsbestimmung ist ein entscheidender erster Schritt für die anschließende Verarbeitung von Proteinproben, einschließlich ihrer Isolierung, Trennung und Analyse. Je nach erforderlicher Genauigkeit, Empfindlichkeit und Reinheit der Proteinproben können verschiedene Methoden zur Messung der Proteinkonzentration angewendet werden, wobei unterschiedliche Detektionstechniken – kolorimetrische und fluorimetrische Bestimmung – zum Einsatz kommen. (1) Angesichts der wachsenden Nachfrage nach Hochdurchsatz-Proteinkonzentrationsbestimmung in verschiedenen Bereichen wie der Wirkstoffforschung, Proteomik und Therapeutika werden Laborautomations-Workflows für die Proteinkonzentrationsbestimmung immer wichtiger. Automatisierte Laborprozesse verbessern die Zuverlässigkeit, Effizienz und den Durchsatz von Experimenten und reduzieren gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit manueller Fehler. Die Automatisierung einiger etablierter, häufig verwendeter kolorimetrischer und Protein-Kupfer-Chelatbildungsmethoden, wie Bradford (Coomassie), Bicinchoninsäure (BCA) und Lowry, könnte sich daher bei der Proteinkonzentrationsbestimmung und Analyse-Workflows als vorteilhaft erweisen. (2)
In dieser gemeinsamen Studie mit Eppendorf präsentieren wir einen automatisierten BCA-Assay, der durch den Absorbance 96 Automate, einen Mikroplatten-Reader, der auf dem epMotion® Liquid-Handling-System integriert ist, ermöglicht wird. Zunächst wurde die Leistung des Absorbance 96 Automate durch den Vergleich mit einem anderen Tisch-Mikroplatten-Reader bewertet. Die Ergebnisse zeigten identische Messwerte mit ähnlicher Reproduzierbarkeit und Linearität, was die Wirksamkeit und Empfindlichkeit des Absorbance 96 Automate bei der Durchführung der automatisierten Proteinkonzentrationsbestimmung bestätigte. Anschließend zeigte eine vergleichende Studie zwischen manuellen und automatisierten Workflows beschleunigte Verfahrensschritte im automatisierten Workflow, was zu einer erheblichen Reduzierung der Gesamtzeit führte, die für die Durchführung des gesamten BCA-Assays erforderlich ist.
Automatisierter BCA Assay Workflow
Die Proteinkonzentrationsbestimmung wurde mit dem Pierce™ Microplate BCA Protein Assay Kit von Thermo Fisher Scientific durchgeführt. Nach dem Herstellerprotokoll wurde ein automatisierter Workflow unter Verwendung der epBlue Software und des epMotion® Liquid-Handling-Systems etabliert. Dieser automatisierte Prozess wurde entwickelt, um Absorptionsmessungen bei 562 nm zu erfassen, was durch den on-deck integrierten Absorbance 96 Automate ermöglicht wurde. Zunächst wurde die Standardkurve für Bovine Serum Albumin (BSA) erstellt, die 7 Datenpunkte in Dreifachbestimmung umfasste. Anschließend wurde die Messung unbekannter Proben (4 Replikate) über vier Verdünnungsbereiche hinweg durchgeführt.
Ergebnisse
Vergleichbare Messwerte und identische Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit demonstriert durch Absorbance 96 Automate und GloMax® Discover
In der vergleichenden Analyse wurde die BSA-Standardkurvenanalyse durch Messung der Absorption der Standardproteinproben bei 562 nm mit dem Absorbance 96 Automate und bei 560 nm mit dem GloMax® Discover Mikroplatten-Reader (Promega) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten vergleichbare optische Dichte (OD)-Messwerte mit hoher Korrelation (Abb. 1A). Die anschließende Untersuchung der OD-Werte unbekannter Proteinproben, die mit beiden Geräten erhalten wurden, zeigte ebenfalls ähnliche Ergebnisse (Abb. 1B) mit einer hohen Korrelation (R² = 0,9989) (Abb. 1C). Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Absorbance 96 Automate eine ähnliche Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit und Linearität innerhalb des dynamischen Bereichs aufweist wie der GloMax® Discover.
Zusätzlich ist hervorzuheben, dass der Absorbance 96 Automate eine kürzere Auslesezeit (2 Sekunden) als der GloMax® Discover (52 Sekunden) aufwies, was seine Effizienz bei der Beschleunigung der schnellen Datenerfassung unterstreicht.
Verbesserte Effizienz und Zeitersparnis durch den automatisierten Proteinanalyse-Workflow
Es wurde eine vergleichende Analyse durchgeführt, um den Vorteil des automatisierten Workflows im BCA-Assay-Workflow durch die Anwendung sowohl automatisierter als auch manueller Methoden zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Korrelation der Probenkonzentration zwischen den beiden Methoden (Abb. 2), was die effiziente Leistung des automatisierten Workflows im Vergleich zum manuellen Ansatz validiert.
Bemerkenswert ist, dass im Vergleich zum manuellen Workflow (90 Minuten) der automatisierte Workflow (71 Minuten) eine erhebliche Verkürzung der gesamten Analysezeit aufwies. Der automatisierte Workflow ermöglichte ein direktes Plattenauslesen ohne Benutzereingriff, wodurch die Benutzerzeit während der Durchführung des BCA-Assays optimiert und eingespart wurde.
Zusammenfassung
Die Ergebnisse der vergleichenden Studie zwischen dem Absorbance 96 Automate und dem GloMax® Discover Mikroplatten-Reader bestätigen die Wirksamkeit des Absorbance 96 Automate bei der Durchführung des BCA-Assays, indem sie vergleichbare Ausleseempfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Linearität demonstrieren. Die Integration des Absorbance 96 Automate auf dem Deck des epMotion® Liquid-Handling-Systems ermöglicht einen erhöhten Durchsatz bei der Proteinanalyse, gekennzeichnet durch höhere Geschwindigkeit und Präzision im Vergleich zum manuellen Workflow.
Referenzen
- Noble JE. und Bailey MJA. Kapitel 8 Quantitation of Protein', Methods in Enzymology 2019, 463(C), S. 73–95.
2. Brady PN und Macnaughtan MA. Evaluierung kolorimetrischer Assays zur Analyse reduktiv methylierter Proteine: Verzerrungen und mechanistische Einblicke', Analytische Biochemie 2015, 491, S. 43.
