Die Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm, bekannt als OD600-Messung, ist die einfachste Methode zur Abschätzung der Bakterienkonzentration in einer Probe. Aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit ist diese Methode der häufigste Ansatz zur Messung des Bakterienwachstums, mit Anwendungen in verschiedenen biologischen und medizinischen Forschungsbereichen.
Fakt 1: OD600 misst die Lichtstreuung in Kulturmedien
OD600 misst den Grad der Lichtstreuung (600 nm), der durch die Anwesenheit von Partikeln in einer Lösung oder in Kulturmedien verursacht wird. Je mehr Partikel (Mikroorganismen) in der Lösung vorhanden sind, desto mehr Licht wird von ihnen gestreut (1,2). Die OD600-Methode bestimmt den Anteil des Lichts, das die Suspension von Mikroorganismen durchdringt (durchgelassene optische Intensität), wie in der Abbildung unten gezeigt. Die Menge des durchgelassenen Lichts kann zur Berechnung der Partikelkonzentration in dieser Lösung verwendet werden, da die Menge des von einer Probe absorbierten Lichts mit ihrer Konzentration zusammenhängt (Beer-Lambert-Gesetz) (3,4).
Fakt 2: Warum wird typischerweise bei 600 nm gemessen?
Die Wellenlänge von 600 nm wird speziell für die bakterielle OD-Messung gewählt, da es sich um die bekannte Wellenlänge handelt, die im Vergleich zu UV-Wellenlängen sicher und nicht schädlich für Bakterien ist (5). Zusätzlich können andere Wellenlängen Licht streuen, wenn sie auf DNA, RNA oder Proteine treffen. Auch bei dieser Wellenlänge ist die Absorption in mikrobiellen Spezies und organisch gelösten Stoffen im Wasser sehr gering, und nur die Streuung spielt eine Schlüsselrolle.
Fakt 3: Die OD600-Messung bestimmt das Wachstumsstadium der Bakterienkultur
Das Verständnis der bakteriellen Wachstumsphase und ihrer Konzentration in Kulturproben hat viele Anwendungen, die von der mikrobiellen Produktion in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie bis zur Entwicklung neuer Antibiotika und der synthetischen Biologie reichen. Im Allgemeinen redesignen Forscher Mikroorganismen und kultivieren sie. Nach der Analyse des Wachstums können Bakterien unter optimalen Bedingungen für weitere Charakterisierung und Studien geerntet werden. Unter günstigen Bedingungen können sich Bakterien schnell exponentiell vermehren. In einem experimentellen Aufbau ist es möglich, das bakterielle Wachstumsstadium durch Messung der OD600 vorherzusagen. Die logarithmische Wachstumskurve stellt die Anzahl der lebenden Bakterien in der Population über die Zeit dar. Entlang dieser Kurve können verschiedene Phasen beschrieben werden (6,7).
- Die Lag-Phase ist die anfängliche Phase des Zellwachstums, in der die Zellen aktiv sind und sich an die neue Umgebung anpassen, sich aber in dieser Periode nicht teilen. Während dieser Phase findet die Synthese von RNA, Enzymen und anderen Molekülen statt, die es den Bakterien ermöglichen, die Proliferation in späteren Phasen zu initiieren.
- Während der exponentiellen oder Log-Phase beginnen die Zellen zu proliferieren und das Zellwachstum wird eingeleitet. In dieser Phase teilen sich die Zellen exponentiell und die Aktivität aller Zellen ist gleichmäßig. Daher entspricht die Steigung der Wachstumskurve der bakteriellen Wachstumsrate.
- Die Proliferation nimmt in der stationären Phase aufgrund der Erschöpfung der verfügbaren Nährstoffe und der Anreicherung von Abfallprodukten ab. Infolgedessen erreicht die Zelldichte ihre maximale Dichte, und die Anzahl der Zellen wird konstant – sterbende Zellen werden durch neu wachsende Zellen ersetzt.
- Die Ansammlung von Abfallprodukten und der Mangel an Nährstoffen erhöhen den Zelltod. In dieser Absterbephase nimmt die Anzahl der lebenden Zellen exponentiell ab.
Fakt 4: Wie man OD600-Messungen durchführt
Typischerweise wird ein Tischspektralphotometer zur Messung der OD600 verwendet. Eine Probe (Bakterienkultur) wird in eine Küvette gegeben und in das Spektralphotometer eingesetzt. Eine Lichtquelle von 600 nm wird auf die Probe gerichtet – Zellen in der Probe streuen das Licht, und das durchgelassene Licht wird detektiert, was eine Ablesung liefert. Diese Ablesung wird verwendet, um die Konzentration der Bakterien in der Probe zu bestimmen/schätzen. Um die Konzentration einer unbekannten Bakterienkonzentration zu messen, wird eine Standard-OD600-Kalibrierkurve bekannter Bakterienkonzentration erstellt, und dann werden die OD600-Werte unbekannter Proben verfolgt, um die unbekannte Bakterienkonzentration zurückzurechnen. Eine ordnungsgemäße Kalibrierung ist entscheidend für die Bestimmung der Ergebnisse.
Lernen Sie die Grundlagen: Entdecken Sie den Zusammenhang zwischen OD, Absorption und Transmission
Tipps und Know-how für OD600-Messungen
Tipp 1: Achten Sie auf Temperaturstabilität während der Bakterienkultur
Die Temperatur ist einer der wichtigsten Faktoren, die das Bakterienwachstum regulieren. Bei niedrigen Temperaturen ist die Effizienz des Bakterienwachstums im Vergleich zu höheren Temperaturen im Bereich von 25 bis 30 Grad reduziert. Reduzierte Enzymaktivitäten bei niedrigeren oder Gefriertemperaturen können die bakterielle Proliferation drastisch beeinflussen. Im Gegensatz dazu fördern höhere Temperaturen die Enzymaktivität und somit das Bakterienwachstum; bei zu hohen Temperaturen nimmt die Enzymaktivität jedoch aufgrund der Proteindenaturierung ab. Beachten Sie, dass jeder Mikroorganismus seinen Temperaturbereich für optimales Bakterienwachstum hat (7–9).
Tipp 2: Mischen Sie die Proben vor der OD600-Messung gut
Während der Bakterienkultur ist es entscheidend, den Inokulationskolben zu schütteln, um eine ordnungsgemäße Vermischung der Lösungsmittel und die Aufrechterhaltung aerober Bedingungen für eine optimale Sauerstoffaufnahme zu gewährleisten, die für das Bakterienwachstum erforderlich ist (10,11). Auch bei der Entnahme einer Bakterienprobe aus der Kultur ist es wichtig, sie gut zu mischen und die OD600-Messungen sofort durchzuführen, um eine Ablagerung von Zellen am Boden der Küvette zu vermeiden, die zu ungenauen Ergebnissen führen würde.
Tipp 3: Kennen Sie die Eignung Ihrer Bakterienprobe
Bestimmte Bakterien sind für diese Methode nicht geeignet; sie werden als OD-transparente Bakterien bezeichnet, da sie Licht erheblich durchlassen und daher eine reduzierte Streuung zeigen (12). OD-transparente Bakterien werden daher nicht über OD600-Messungen detektiert. Wenn sich die Größe Ihrer Bakterien während der Wachstumsmessungen ändert, ist Vorsicht geboten, da die Größe der Partikel (z.B. Bakterien) OD600-Messungen beeinflussen kann – größere Partikel streuen mehr Licht. Zusätzlich enthalten einige Bakterien wie Cyanobakterien und blaugrüne photosynthetische Algen Chlorophyll und Phycocyanin-Pigmente. Aufgrund des Vorhandenseins dieser spezifischen Pigmente kann die OD-Messung bei 600 nm durch Absorption in diesem Bereich des Lichtspektrums verändert werden.
Tipp 4: Erstellen Sie Ihre Standard-Kalibrierkurve
Der OD600-Messwert ist kein absoluter Wert. Er repräsentiert lediglich die Menge des von Ihrer Bakterienprobe gestreuten Lichts, jedoch kann die OD600-Messung zur Schätzung der Zelldichte (Zellen/ml) in Ihrer Probe verwendet werden. Es wird dringend empfohlen, Verdünnungsexperimente mit Ihrer Probe durchzuführen, um eine Kalibrierkurve von OD600 vs. Zellen/ml (KBE – koloniebildende Einheit) zu erstellen. Der Gradient des linearen Teils der Kurve stellt den Umrechnungsfaktor (Zelldichte in 1 OD-Einheit) dar. Erstellen Sie Standard-Kalibrierkurven für jede verschiedene Probe und sogar für verschiedene Spektralphotometer, falls diese für die OD-Messung verwendet werden.
Referenzen
1. Stevenson K, McVey AF, Clark IBN, Swain PS, Pilizota T. General Calibration of Microbial Growth in Microplate Readers. Sci. Reports 2016 61 2016, 6 (1), 1–7.
2. Mandelstam J, McQuillen K, Dawes IW. Biochemistry of Bacterial Growth. 1982, p:449.
3. Wenzel T. 1.2: Beer’s Law - Chemistry LibreTexts.
4. Beer C. Bestimmung Der Absorption Des Rothen Lichts in Farbigen Flüssigkeiten. Ann. Phys. 1852, 162 (5), 78–88.
5. Huntress A. OD600 Measurements: An Easy Guide for Researchers Using Bacterial Cultures: bitesizebio.
6. Koseki S, Nonaka J. Alternative Approach to Modeling Bacterial Lag Time, Using Logistic Regression as a Function of Time, Temperature, PH, and Sodium Chloride Concentration. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (17), 6103–6112.
7. Peter JJ. Bacterial Metabolism. Med. Microbiol. 1996.
8.14.3: Low Temperatures - Biology LibreTexts
9. Augustin JC, Rosso L, Carlier V. Estimation of Temperature-Dependent Growth Rate and Lag Time of Listeria Monocytogenes by Optical Density Measurements. J. Microbiol. Methods 1999, 38 (1–2), 137–146.
10. Park J, Bansal T, Pinelis M, Maharbiz MM. A Microsystem for Sensing and Patterning Oxidative Microgradients during Cell Culture. Lab Chip 2006, 6 (5), 611–622.
11. Yazdani M. Technical Aspects of Oxygen Level Regulation in Primary Cell Cultures: A Review. Interdiscip. Toxicol. 2016, 9 (3–4), 85.
12. Myers JA, Curtis BS, Curtis WR. Improving Accuracy of Cell and Chromophore Concentration Measurements Using Optical Density. BMC Biophys. 2013 61 2013, 6 (1), 1–16.
