Lumineszenz-Assays sind ein Eckpfeiler der Arzneimittelforschung und der Umweltanalytik. Diese Assays nutzen das Licht, das von chemischen Reaktionen emittiert wird, um biologische Prozesse zu messen. Eine kritische Herausforderung ist jedoch das Lumineszenz-Crosstalk. Dieses Phänomen kann die Genauigkeit und Zuverlässigkeit Ihrer Ergebnisse beeinträchtigen.
Dieser umfassende Leitfaden befasst sich mit den Feinheiten des Lumineszenz-Crosstalk, erklärt seine Mechanismen und Ansätze zur Minimierung seiner Auswirkungen. Tauchen wir ein!
Was ist Lumineszenz-Crosstalk?
Lumineszenz-Crosstalk bezeichnet die unerwünschte Übertragung oder Interferenz von Lumineszenzsignalen zwischen benachbarten Regionen. Bei Lumineszenz-Assays tritt Crosstalk auf, wenn unerwünschte Signale aus benachbarten Wells erkannt werden, während ein bestimmtes Well in einer Mikroplatte gemessen wird (Abb. 1). 
Stellen Sie sich vor, Sie befinden sich in einem dunklen Raum und versuchen, ein Buch bei Kerzenlicht zu lesen. Die Kerzenflamme spendet ein warmes Licht, perfekt zum Lesen der Worte. Doch die Dinge werden unübersichtlich, wenn Sie plötzlich die Vorhänge öffnen und das strahlende Sonnenlicht hereinlassen. Das Sonnenlicht (starkes Signal aus einem benachbarten Well) überlagert das Kerzenlicht (schwaches Signal aus Ihrem Ziel-Well). Sie können das Buch immer noch technisch lesen, aber die Details zu erkennen, erfordert viel Arbeit. Das ist Crosstalk in Aktion! Das starke Signal "blutet über" und beeinträchtigt Ihre Fähigkeit, das schwächere, relevantere Signal zu sehen.
Arten von Lumineszenz-Crosstalk
Das Verständnis der verschiedenen Arten von Lumineszenz-Crosstalk ist unerlässlich, um effektive Minderungsstrategien für genauere und zuverlässigere Assayergebnisse umzusetzen.
Geräte-Crosstalk
Licht aus benachbarten Wells gelangt direkt zum Detektor durch Lücken im Design des Mikroplatten-Readers.
Um das Beispiel von Kerze und Sonnenlicht aufzugreifen: Stellen Sie sich vor, Sonnenlicht dringt durch kleine Risse in den Vorhängen, ähnlich wie Licht durch Lücken im Mikroplatten-Reader schlüpft.
Platten-Crosstalk
Licht dringt durch die Well-Wände, insbesondere bei klaren oder dünnen Platten, und beeinflusst das Signal des Ziel-Wells. Je mehr Licht eine lumineszierende Reaktion emittiert, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Teil davon durch die Wände „sickert“.
Es ist also, als würde das Sonnenlicht durch dünne Vorhänge dringen, was den Effekt von Licht nachahmt, das durch die Well-Wände geht. 
Auswirkungen von Crosstalk auf Ihre Lumineszenzmessungen
Crosstalk ist bei Lumineszenz-Assays unerwünscht, hauptsächlich weil es unerwünschte Signallecks innerhalb der Wells verursacht und die Genauigkeit und Zuverlässigkeit beeinträchtigt:
Verringerte Empfindlichkeit
Crosstalk kann das Hintergrundsignal erhöhen und die Empfindlichkeit des Assays reduzieren. Dies erschwert die genaue Detektion niedriger Lumineszenzsignale aus der Zielprobe.
Falsche Signale
Crosstalk kann falsch-positive oder falsch-negative Signale erzeugen, was zu fehlerhaften Schlussfolgerungen über die analysierte Probe führt. Crosstalk kann zu einer Überschätzung des Lumineszenzsignals führen, insbesondere in Wells, die niedrige Konzentrationen von lumineszierendem Material enthalten.
Wie man Lumineszenz-Crosstalk misst
Die Messung des Lumineszenz-Crosstalk zwischen Wells in einem Multi-Well-Platten-Assay beinhaltet die Bewertung des unbeabsichtigten Lumineszenzsignals, das von einem Well auf benachbarte Wells übergreift. Dies gewährleistet genaue Messwerte in Formaten mit hoher Dichte wie 96-Well- oder 384-Well-Platten.
Um Lumineszenz-Crosstalk zu messen, entwerfen Sie das Plattenmuster, indem Sie positive Kontroll-Wells mit lumineszierenden Markern und benachbarte Leer-Wells oder mit Wasser gefüllte Wells als negative Kontrollen vorbereiten (Abb. 3). Crosstalk kann als Prozentsatz des Primärsignals quantifiziert werden, indem die lumineszierenden Signale aus den positiven Kontroll-Wells gemessen und mit den in den benachbarten Leer-Wells detektierten Signalen verglichen werden. Dieser Vorgang sollte über die gesamte Platte wiederholt werden, um das Crosstalk-Muster zu erfassen. Der Crosstalk-Wert kann auch in Zehnerpotenzen (logarithmischer Wert) dargestellt werden, insbesondere bei sehr geringen Crosstalk-Werten oder beim Vergleich eines breiten Bereichs von Signalintensitäten. Zum Beispiel könnte ein Crosstalk-Level als 10⁻⁵ beschrieben werden, was bedeutet, dass das Crosstalk-Signal ein Hunderttausendstel (0,00001) des Primärsignals beträgt.
Lumineszenz-Crosstalk-Studien werden typischerweise in opaken weißen Platten durchgeführt. Es ist wichtig zu beachten, dass der berechnete Lumineszenz-Crosstalk-Wert das Ausmaß des Crosstalk für Ihre spezifische Platte und Luminometer-Einstellung darstellt. Daher müssen die Crosstalk-Werte neu berechnet werden, wenn eine andere Platte oder ein anderes Luminometer verwendet wird.
Auswirkungen des Designs von Lumineszenz-Plattenreadern auf das Crosstalk
Das Design eines Lumineszenz-Plattenreaders hat einen erheblichen Einfluss auf den Geräte-Crosstalk und beeinflusst die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Lumineszenzmessungen. Wichtige Aspekte sind:
Optische Lichtabschirmung
Einige Plattenreader verwenden zusätzliche Lichtabschirmmechanismen oder Technologien zwischen Detektor und Lichtweg, um Streulicht zu blockieren, wodurch der optische Pfad-Crosstalk weiter reduziert wird.
Detektorpositionierung
Die Position des Detektors relativ zu den Wells kann den Crosstalk beeinflussen. Detektoren, die näher an den Wells positioniert sind, nehmen das direkte Licht aus dem Well auf und eliminieren so die Möglichkeit der Streulichterfassung. 
Lernen Sie Luminescence 96 kennen
Verschiedene Lumineszenz-Plattenreader bieten unterschiedliche Crosstalk-Werte, basierend auf den verschiedenen Technologien, die in ihr Design und ihre Funktion integriert sind. Die Phosentix MicroQC-Platte wird im Allgemeinen verwendet, um die Crosstalk-Werte von Lumineszenz-Plattenreadern zu quantifizieren.
Gängige Strategien zur Bekämpfung von Crosstalk in Ihrem Lumineszenz-Assay
Nachdem Sie Crosstalk und seine potenziellen negativen Auswirkungen auf Ihre Experimente verstanden haben, ist es unerlässlich, Strategien zu implementieren, um seine Auswirkungen zu mindern. Einige zusätzliche Tipps und Strategien für die Einrichtung von Lumineszenz-Assays sind:
Mikroplattenauswahl
Schwarze Mikroplatten zeigen das geringste Crosstalk, gefolgt von hellgrauen Mikroplatten. Sie reduzieren den Lichteintritt im Vergleich zu weißen Platten erheblich.
Signalkalibrierung
Kalibrieren Sie Ihren Lumineszenz-Reader mit Standards oder Kontrollproben bekannter Konzentrationen. Diese Kalibrierung hilft, eine Basislinie für die erwarteten Signalintensitäten festzulegen.
Leere Wells als Pufferzonen
Fügen Sie leere Wells zwischen Ihren Proben ein, um eine physische Barriere gegen Signalüberlappung zu schaffen, was auch den Crosstalk verringern könnte.
Crosstalk-Identifikation
Analysieren Sie Ihre Rohdaten, um potenzielle Crosstalk-Signale zu identifizieren. Achten Sie auf unerwartete Signalmuster oder Diskrepanzen zwischen benachbarten Wells, die auf Interferenzen hinweisen könnten.
Crosstalk-Korrekturalgorithmen
Einige Plattenreader verfügen über Software, die Crosstalk-Korrekturalgorithmen enthält. Diese Algorithmen können Crosstalk basierend auf der Intensität und dem Ort des detektierten Lichts identifizieren und subtrahieren, wodurch die Genauigkeit der Messungen verbessert wird.
Es ist wichtig zu beachten, dass alle oben diskutierten Strategien Ihnen nur helfen werden, Platten-Crosstalk in Ihrem Lumineszenz-Assay zu mindern. Geräte-Crosstalk ist spezifisch für bestimmte Mikroplatten-Reader und kann vom Benutzer nicht geändert oder minimiert werden. Daher ist die Auswahl eines Mikroplatten-Readers mit minimalem Geräte-Crosstalk entscheidend für zuverlässige Ergebnisse und Analysen.
Fazit
Das Verständnis und die Minimierung von Lumineszenz-Crosstalk ist unerlässlich, um genaue und zuverlässige Ergebnisse in Ihren Assays zu erzielen. Durch die Implementierung der in diesem Leitfaden beschriebenen Strategien können Sie Crosstalk minimieren und die Präzision Ihrer Messungen verbessern. Die Auswahl des richtigen Lumineszenz-Mikroplatten-Readers und Plattentyps kann einen erheblichen Unterschied machen. Denken Sie daran, Sie möchten kein Buch bei Kerzenlicht an einem hellen sonnigen Tag lesen; das ist Crosstalk!
