Spektrophotometrische Assays sind unverzichtbare Werkzeuge in der wissenschaftlichen Forschung und ermöglichen eine schnelle und präzise Quantifizierung in verschiedenen wissenschaftlichen Disziplinen. Das Verständnis, wie Licht mit einer Probe interagiert, liefert entscheidende Informationen über deren Eigenschaften, einschließlich der Konzentration. Tauchen wir tief in einige wichtige Fakten ein, die häufig bei der Durchführung solcher Assays anzutreffen sind: optische Dichte (OD), Absorption und Transmission.
Was ist optische Dichte?
Die optische Dichte (OD) misst die Abschwächung der Lichtintensität, wenn diese ein Medium durchläuft. Praktisch misst sie die Lichtmenge, die von der Lösung aufgenommen wird. Es handelt sich um eine logarithmische Größe, die den Kehrwert der Transmission (T) beschreibt, welche das Verhältnis der durch ein Material transmittierten Lichtintensität (I) zur Intensität des einfallenden Lichts (I₀) ist.
OD-Formel: OD = - Log₁₀(T) = Log₁₀ (I₀ / I)
Stellen Sie sich vor, Sie schießen einen Lichtstrahl mit 100 Photonen auf eine Substanz (Abb. 1). Während das Licht wandert, werden einige Photonen von der Substanz absorbiert, während andere in verschiedene Richtungen gestreut werden (stellen Sie sich vor, sie prallen wie Billardkugeln herum). Wenn nur 10 der ursprünglichen 100 Photonen es schaffen, hindurchzukommen und auf der anderen Seite wieder herauszukommen, dann wäre die OD:
OD = Log₁₀10 (100/10) = 1
Eine OD von 0 bedeutet, dass das gesamte Licht transmittiert wird, während eine OD von unendlich bedeutet, dass das gesamte Licht absorbiert wird. Die OD wird sowohl durch Absorption als auch durch Streuung beeinflusst, die zum OD-Wert beitragen.
Was ist Lichtabsorption?
Absorption bezieht sich auf die Lichtmenge, die eine Substanz bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Sie misst die Wechselwirkung zwischen Licht und der Fähigkeit des Materials, diese spezifische Lichtenergie zu absorbieren (Abb. 2). Eine höhere Absorption deutet auf eine stärkere Absorption hin.
Zum Beispiel ermöglichen Techniken wie der BCA-Assay Wissenschaftlern, die Gesamtmenge an Protein in einer Lösung durch Messung der Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge abzuschätzen. Je höher die Absorption, desto mehr Protein ist wahrscheinlich vorhanden.
Was ist Lichtstreuung?
Lichtstreuung tritt auf, wenn Licht aufgrund von Wechselwirkungen mit Partikeln oder Unregelmäßigkeiten innerhalb eines Mediums von seinem Weg abweicht (Abb. 2). Diese Streuung kann die Messung der optischen Dichte beeinflussen, indem sie die Menge des gestreuten oder transmittierten Lichts der Probe beeinflusst.
In praktischen Anwendungen wird Lichtstreuung beispielsweise bei Trübungsmessungen zur Bestimmung der Bakterienkonzentration oder des Wachstums eingesetzt. Wenn Licht eine Bakterien enthaltende Lösung durchläuft, streuen die Bakterien das Licht in verschiedene Richtungen. Dies trägt zur gesamten Reduzierung des transmittierten Lichts bei und beeinflusst die OD-Messung. Eine Erhöhung der Bakterienkonzentration (mehr Streuer) führt also zu einem höheren OD-Wert.
Bevor wir auf weitere Details eingehen, ist es wichtig zu beachten, dass die optische Dichte (OD) sowohl die Lichtabsorption als auch die Streuung berücksichtigt. In praktischen Anwendungen wird OD jedoch häufig austauschbar mit Absorption verwendet, hauptsächlich wenn die Lichtstreuung minimal oder konsistent ist.
Zusammenhang: Transmission zur Absorption
Die Transmission (T) ist der Anteil des Lichts, der eine Probe im Vergleich zur anfänglichen Lichtintensität durchdringt. Sie ist ein Maß dafür, wie viel Licht durchgelassen wird. Die Transmission wird berechnet als T = I / I₀. Die Transmission kann auch als Prozentsatz ausgedrückt werden T (%) = (I / I₀) x 100
wobei:
- T die Transmission ist (einheitenlos)
- I die Intensität des durch die Probe transmittierten Lichts ist
- I₀ die Intensität des einfallenden Lichts ist
Die Transmission reicht von 0 bis 1, wobei:
- T = 1 bedeutet, dass das gesamte Licht durchgelassen wurde und die Probe vollständig transparent ist.
- T = 0 bedeutet, dass kein Licht durchgelassen wurde und die Probe das Licht vollständig absorbiert hat.
Die Absorption (A) hingegen gibt an, wie viel Licht die Probe absorbiert. Es ist die Kehrseite der Transmission. Die Absorption wird mit dem Logarithmus des Kehrwerts der Transmission berechnet: A = Log₁₀(1/ T) = Log₁₀ (I₀ / I)
Es besteht ein umgekehrtes Verhältnis zwischen Absorption und Transmission. Wenn die Menge des absorbierten Lichts (A) zunimmt, nimmt die Menge des transmittierten Lichts (T) ab und umgekehrt. Daher gilt:
- A = 0 bedeutet, dass 100 % des Lichts durch die Probe transmittiert wurden
- A = 1 bedeutet, dass 10 % des Lichts durch die Probe transmittiert wurden
- A = 2 bedeutet, dass 1 % des Lichts durch die Probe transmittiert wurde
Wie misst ein Spektralphotometer die Absorption?
Die nächste Frage, die sich stellt, ist: Wie können wir ein Spektralphotometer zur Absorptionsmessung einsetzen? Vereinfachen wir den Prozess in leicht verständliche Schritte:
- Das Spektralphotometer sendet Licht verschiedener Wellenlängen aus. Typischerweise deckt diese Lichtquelle mehrere verschiedene Wellenlängenbereiche ab, wie Ultraviolett (UV), sichtbar und nahinfrarot (NIR).
- Das emittierte Licht durchläuft einen Monochromator oder ein filterbasiertes System. In beiden Fällen wählt das System eine bestimmte Wellenlänge des Lichts aus, um sicherzustellen, dass nur Licht der gewünschten Wellenlänge die Probe erreicht. Zum Beispiel wird für die bakterielle OD600-Messung nur eine Wellenlänge von 600 nm durch die Probe gelassen.
- Die ausgewählte Wellenlänge des Lichts durchläuft dann die Probenkammer, wo die zu analysierende Substanz platziert ist.
-
Auf der anderen Seite der Probenkammer befindet sich ein Detektor, der die Menge des durch die Probe transmittierten Lichts und des absorbierten Lichts misst.
Treffen Sie Absorbance One
Das Beer-Lambert-Gesetz beleuchten: Absorption und Konzentration verbinden
Nachdem wir nun Absorption und Transmission behandelt haben, fragen Sie sich vielleicht, warum diese Konzepte wichtig sind. Sie sind unerlässlich, weil sie es uns ermöglichen, die Konzentration einer Probe mithilfe des Beer-Lambert-Gesetzes zu messen. Lassen Sie uns tief in einige Grundlagen der Berechnung oder Bestimmung der Konzentration aus der Absorption eintauchen.
Das Beer-Lambert-Gesetz ist das grundlegende Prinzip, das die Beziehung zwischen Lichtabsorption und den Eigenschaften der Substanz beschreibt (Abb. 3). Es besagt, dass das absorbierte Licht direkt proportional zur Konzentration der Probe und zur Weglänge des Lichts durch die Lösung ist:
A = εlc
Wo,
- A die Absorption ist (dimensionslos)
- ε der molare Absorptionskoeffizient ist (M⁻¹cm⁻¹)
- l die Weglänge des Lichts durch die Lösung ist (cm)
- c die Konzentration der absorbierenden Probe ist (M)
Die Absorption zeigt daher gemäß dem Beer-Lambert-Gesetz eine lineare Beziehung zur Konzentration.
Grenzen des Beer-Gesetzes: Wenn die Absorption die Konzentration nicht linear widerspiegelt
Das Beer-Gesetz ist ein fantastisches Werkzeug zur Abschätzung der Konzentration basierend auf der Absorption, aber es gibt einen Haken: Es gilt nur unter bestimmten Bedingungen. Bei hohen Konzentrationen rücken die Probenmoleküle näher zusammen. Dies kann zu stärkeren Wechselwirkungen zwischen ihnen und Lichtstreuung führen, was die Art und Weise, wie sie Licht absorbieren, verändern kann. Das Beer-Gesetz geht von einer einfachen proportionalen Beziehung aus, und diese Wechselwirkungen bei hohen Konzentrationen stören diese Linearität (Abb. 4).
Daher weicht die Beziehung zwischen Absorption und Konzentration in solchen Situationen von der schönen geraden Linie ab, die vom Beer-Gesetz vorhergesagt wird; wenn Sie also das Beer-Gesetz auf eine Probe anwenden, die zu konzentriert ist, erhalten Sie wahrscheinlich eine ungenaue Schätzung der tatsächlichen Konzentration.
Fazit
Das Verständnis des Zusammenspiels von OD, Absorption und Transmission ist entscheidend für genaue spektrophotometrische Messungen. Die Beherrschung dieser Konzepte kann die Präzision Ihrer Experimente verbessern und Ihre Daten sicher interpretieren. Beachten Sie diese Prinzipien, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse in Ihrer Forschung zu gewährleisten.
