Bei der Auswahl der idealen Detektionstechnologie für Ihre Forschung oder Anwendung müssen Sie sich möglicherweise zwischen Absorptions- und Lumineszenz-Assays entscheiden. Beide Methoden werden häufig in der Forschung eingesetzt, weisen jedoch wichtige Unterschiede auf, die es zu beachten gilt. Das Verständnis dieser Unterschiede ist entscheidend, um genaue und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen und Ihre Forschungsfragen effektiv zu beantworten.
In diesem Artikel werden wir die wichtigsten Faktoren untersuchen, die bei der Auswahl zwischen Absorptions- und Lumineszenz-Assays zu berücksichtigen sind, um Ihnen zu helfen, diese Optionen sicher zu beherrschen.
Detektionsprinzip: Absorption vs. Lumineszenz
Absorptionsassays quantifizieren die Lichtmenge, die eine Probe bei bestimmten Wellenlängen absorbiert. Wenn Licht durch die Probe dringt, wird ein Teil absorbiert, während der Rest durchgelassen wird (Abb. 1). Gemäß dem Beer'schen Gesetz ist die gemessene Absorption einer Lösung direkt proportional zur Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten. Populäre Beispiele sind kolorimetrische Assays wie ELISA und Bradford-Assays.
Lumineszenz-Assays hingegen basieren auf dem Phänomen, dass Substanzen nach der Absorption von Energie Licht emittieren (1). Diese Energie kann aus verschiedenen Quellen stammen:
- Photolumineszenz: Licht wird nach Absorption von Photonen emittiert. Dies umfasst Prozesse wie Fluoreszenz und Phosphoreszenz.
- Chemilumineszenz: Licht wird durch eine chemische Reaktion erzeugt (Abb. 1).
- Biolumineszenz: Licht wird durch biochemische Reaktionen emittiert.
Verschiedene Lumineszenz-Assays liefern wertvolle Einblicke in die Eigenschaften einer Substanz, wie z.B. deren Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und sogar deren Lokalisation innerhalb einer biologischen Probe (2). Beispiele hierfür sind Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), Reportergen-Assays, ATP-Assays usw. Obwohl es, wie oben erwähnt, verschiedene Arten von Lumineszenz gibt, beziehen wir uns in diesem Artikel speziell auf Chemilumineszenz und Biolumineszenz, wenn der Begriff "Lumineszenz" verwendet wird.
Wichtige Kriterien für die Assay-Auswahl: Absorption vs. Lumineszenz
1. Empfindlichkeit und Nachweisgrenze
Absorptionsassays bieten typischerweise eine niedrige bis moderate Empfindlichkeit. Sie sind anfällig für Interferenzen durch Hintergrundrauschen, das durch Verunreinigungen in der Probe, Probenfarbe oder Trübung verursacht wird, was die Messung beeinträchtigen kann (3). Infolgedessen können diese Faktoren die Wirksamkeit von Absorptionsassays beim Nachweis niedriger Analytkonzentrationen einschränken.
Lumineszenz-Assays sind für ihre hohe Empfindlichkeit bekannt. Da das Licht direkt aus der Probe emittiert wird, ohne dass eine externe Lichtquelle erforderlich ist, gibt es minimale Hintergrundinterferenzen (2), wodurch Lumineszenz-Assays sehr effektiv sind, um sehr geringe Analytkonzentrationen nachzuweisen.
Aufgrund ihrer überlegenen Empfindlichkeit werden Lumineszenz-Assays oft für Forschungszwecke bevorzugt, die den Nachweis sehr geringer Analytkonzentrationen, wie Femtomolare, erfordern. Zum Beispiel verwendeten Cao et al. einen Chemilumineszenz-basierten Assay zum Nachweis des plättchenreichen Wachstumsfaktors B-Kette (PDGF-BB)-Antigens mit einer Nachweisgrenze von 10 fmol (4).
Umgekehrt können Absorptionsassays ausreichend sein, wenn nur eine moderate Empfindlichkeit erforderlich ist, z. B. im Nanomol- bis Mikromolbereich. Ein typisches Beispiel ist der Bradford-Assay (5).
2. Hintergrundinterferenz
Hintergrundinterferenz bezieht sich auf unerwünschte Signale oder Substanzen, die die genaue Messung der Zielsubstanz verzerren können. Absorptionsmessungen hängen von der Übertragung eines Lichtstrahls durch eine Probe ab, wodurch sie anfällig für Hintergrundinterferenzen von allen Komponenten im Lichtweg sind. Verunreinigungen in Proben, Zellfragmente oder andere Ablagerungen können Licht streuen oder absorbieren, was zu Artefakten führt (6). Folglich zeigen Absorptionsassays oft ein hohes Hintergrundsignal.
Im Gegensatz dazu weisen Lumineszenz-Assays im Allgemeinen eine geringere Hintergrundinterferenz auf. Dies liegt daran, dass sie keine externe Lichtquelle benötigen, damit die Probe Licht emittiert, was zu einer geringen oder gar keiner Autofluoreszenz und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis führt (2). Darüber hinaus sind diese Assays weniger empfindlich gegenüber Hindernissen im Lichtweg als Absorptionsassays.
Die reduzierte Hintergrundinterferenz von Lumineszenz-Assays macht sie besonders nützlich in Anwendungen, die hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit erfordern, wie z. B. beim Wirkstoff-Screening (2,7) und in der klinischen Diagnostik, wie dem Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA) zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern (8).
3. Dynamischer Bereich und Linearität
Der dynamische Bereich bezieht sich auf den Konzentrationsbereich von Analyten, den ein Assay genau und präzise quantifizieren kann. Er umfasst den niedrigsten und höchsten Konzentrationsbereich, in dem der Assay den Analyten zuverlässig detektieren und messen kann. Die Linearität gibt an, wie gut die Antwort des Assays (z.B. Signalintensität) direkt proportional zur Konzentration des Analyten ist.
Absorptionsmessungen sind anfällig für Hintergrundinterferenzen, die die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen können. Darüber hinaus gilt die lineare Beziehung zwischen Absorption und Konzentration hauptsächlich bei niedrigeren Analytkonzentrationen (9). Infolgedessen zeigen Absorptionsassays im Allgemeinen einen geringeren dynamischen Bereich, der typischerweise auf 2-3 Größenordnungen begrenzt ist.
Im Vergleich dazu bieten Lumineszenz-Assays einen größeren dynamischen Bereich von 6-7 Größenordnungen (4). Diese überlegene Leistung beruht auf ihrer geringen Hintergrundinterferenz und hohen Empfindlichkeit, die es ihnen ermöglichen, ein breites Spektrum von Konzentrationen – von sehr niedrig bis sehr hoch – genau zu messen, ohne die Linearität zu beeinträchtigen. Lumineszenz-Assays sind aufgrund ihres breiten dynamischen Bereichs besonders effektiv für Reportergen- oder zellbasierte kinetische Assays (10), da sie eine große Bandbreite an Signalintensitäten über die Zeit verfolgen können.
4. Budget (Ausrüstung & Kits)
Geräte: Absorptionsassays erfordern weniger spezialisierte Geräte und können mit Standard-Spektrophotometern oder Absorptionsplattenlesern durchgeführt werden. Absorptionsplattenleser sind in der Regel kostengünstiger. Zum Beispiel kann ein Absorptionsplattenleser je nach verschiedenen Faktoren wie Wellenlängenbereich, Baugröße und Durchsatzkapazitäten zwischen ca. 3.000 und 20.000 US-Dollar kosten. Viele Absorptionsplattenleser fallen auf dem Markt in die Kategorie der günstigeren Geräte (3-10k), bieten jedoch unterschiedliche Leistungsniveaus. Für diejenigen, die einen kostengünstigen, kompakten Plattenleser zur Optimierung ihres Absorptionsassay-Workflows suchen, könnte der Absorbance 96 eine ideale Wahl sein, da er eine gleichzeitige Ablesung aller 96 Vertiefungen in nur 3 Sekunden ermöglicht.
Lumineszenz-Assays sind für ihre höhere Empfindlichkeit bekannt, erfordern jedoch spezielle Geräte wie Luminometer oder Multi-Mode-Plattenleser, die relativ teuer sein können. Je nach verschiedenen Spezifikationen wie Detektionsmodi, Empfindlichkeit oder integriertem Zubehör können Lumineszenz-Plattenleser zwischen 3.500 und 40.000 US-Dollar kosten, wobei die meisten Hochleistungsleser typischerweise in den höheren Preisbereich fallen. Allerdings bietet das Luminescence 96 eine preisgünstigere Option ohne Kompromisse bei der Leistung. Es bietet eine Empfindlichkeit von 100 fmol ATP/Well und einen linearen dynamischen Bereich von 8 Größenordnungen.
Kits: Die Kosten für Kits für Absorptions- und Lumineszenz-Assays können je nach Assay-Typ und spezifischer Anwendung variieren. Zum Beispiel kostet ein Absorptions-basierter Assay wie das Pierce™ Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit etwa 250 $ für 630 Assays in Röhrchen oder 3.800 Assays in Mikrotiterplatten. Ein Lumineszenz-basierter Reportergen-Assay, wie der Revvity twinlite® Dual Luciferase Reportergen-Assay, kostet etwa 280 $ für 100 Assays (96-Well) oder 400 Assays (384-Well).
Um ähnliche Anwendungen zu vergleichen, wie z.B. Zellviabilitäts-Assays, kostet der Absorptions-basierte Invitrogen® CyQUANT® MTT Assay etwa 469 $ für 1.000 Assays (im 96-Well-Format), während der Lumineszenz-basierte CellTiter-Glo® Assay etwa 486 $ für die gleiche Anzahl von Assays kostet. Obwohl Lumineszenz-Assays im Allgemeinen empfindlicher sind, können ihre Kitkosten mit Absorptions-Assay-Kits vergleichbar sein.
5. Spezifische Anwendungen
Absorptionsassays eignen sich für Anwendungen, die eine moderate Empfindlichkeit erfordern. Beispiele hierfür sind die grundlegende Proteinquanti- fizierung (Bradford-Assays), DNA/RNA-Quantifizierung, bakterielle Wachstumsassays und ELISAs.
Lumineszenz-Assays sind jedoch ideal für Anwendungen, die eine hohe Empfindlichkeit und einen breiten Dynamikbereich erfordern. Beispiele hierfür sind Chemilumineszenz-ELISA (CLIA) zur Analytquantifizierung, Protein-Protein-Interaktionen (BRET) und Echtzeit-Kinetikanalysen wie zellbasierte Assays (ATP oder Kinase) oder Genexpressionsanalysen (Luciferase-Reporter-Assay).
6. Assay-Workflow & Komplexität
Absorptionsassays werden häufig eingesetzt und regelmäßig in biowissenschaftlichen Laboren durchgeführt. Im Vergleich zu Lumineszenz-Assays umfassen Absorptionsassays jedoch oft mehr Schritte. Diese Schritte können mehrere Reagenzzugaben, Waschvorgänge und längere Inkubationszeiten umfassen, was sie zeitaufwändiger und komplexer macht und anfälliger für experimentelle Fehler. Darüber hinaus erfordern Absorptionsassays Plattenleser, die die Absorption bei bestimmten Wellenlängen entsprechend den Anforderungen des Assays messen können.
Im Gegensatz dazu sind Lumineszenz-Assays im Allgemeinen einfacher und umfassen weniger Schritte. Reagenzien werden direkt zur Probe gegeben, und die Inkubationszeit ist kürzer, was eine schnelle Detektion und eine schnellere Durchführung des Assays ermöglicht. Für die Messung sind nur Plattenleser erforderlich, die mit Lumineszenz-Detektionsfähigkeiten ausgestattet sind.
Zum Beispiel umfasst der kolorimetrische Zellviabilität-MTT-Assay mehrere Schritte, einschließlich Reagenzzugabe, Waschen, einer 4-stündigen Inkubation und der Messung der Absorption bei 570 nm. Im Gegensatz dazu hat ein Lumineszenz-basierter Zellviabilitäts-Assay einen einfacheren und schnelleren Workflow: Das Reagenz wird direkt zu den Zellen gegeben, und die Lumineszenz wird nach nur 10 Minuten Inkubation mit einem Luminometer gemessen (Abb. 3). Beide Assays werden широко verwendet und liefern zuverlässige Ergebnisse zur Bewertung der Zellviabilität. Die Wahl zwischen ihnen hängt von spezifischen experimentellen Anforderungen ab, wie Empfindlichkeit und verfügbarer Ausrüstung.
Fazit
Die Wahl zwischen Absorptions- und Lumineszenz-Assays hängt oft von verschiedenen Faktoren ab, darunter Hintergrundinterferenzen, Empfindlichkeit, dynamischer Bereich, Assay-Komplexität und Budgetbeschränkungen (Tabelle 1). Durch die Bewertung dieser Kriterien können Sie die Assay-Technologie auswählen, die am besten zu Ihren Forschungszielen passt und die Genauigkeit und Zuverlässigkeit Ihrer Ergebnisse gewährleistet. Ob Sie sich für Absorption oder Lumineszenz entscheiden, eine fundierte Entscheidung ist entscheidend, um optimale Ergebnisse in Ihrer Studie zu erzielen.
Referenzen
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2. Baljinnyam, B., Ronzetti, M., & Simeonov, A. (2022). Advances in luminescence-based technologies for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery, 18(1).
3. Simeonov, A., & Davis, M. I. (2018). Interference with Fluorescence and Absorbance. Assay Guidance Manual.
4. Cao, Z. J., Peng, Q. W., Qiu, X., Liu, C. Y., & Lu, J. Z. (2011). Highly sensitive chemiluminescence technology for protein detection using aptamer-based rolling circle amplification platform. Journal of Pharmaceutical Analysis, 1(3), 159–165.
5. Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry, 236(2), 302–308.
6. Grela, E., Ząbek, A., Grabowiecka, A., (2015) Interferences in the Optimization of the MTT Assay for Viability Estimation of Proteus mirabilis. Avicenna J Med Biotechnol. 7(4):159-67.
7. Cho, E. J., & Dalby, K. N. (2021). Luminescence Energy Transfer–Based Screening and Target Engagement Approaches for Chemical Biology and Drug Discovery. SLAS Discovery, 26(8), 984–994.
8. Montesinos, I., Gruson, D., Kabamba, B., Dahma, H., van den Wijngaert, S., Reza, S., Carbone, V., Vandenberg, O., Gulbis, B., Wolff, F., & Rodriguez-Villalobos, H. (2020). Evaluation of two automated and three rapid lateral flow immunoassays for the detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies. Journal of Clinical Virology, 128, 104413.
9. Mayerhöfer, T., Popp, J., (2019) Beer's Law - Why Absorbance Depends (Almost) Linearly on Concentration. Chemphyschem. 20(4):511-515
10. Neefjes, M., Housmans, B. A. C., van den Akker, G. G. H., L. W. van Rhijn., Welting, T. J. M., van der Kraan, P. M., (2021). Reporter Gene Comparison Demonstrates Interference of Complex Body Fluids with Secreted Luciferase Activity. SciReports: 1359.
